hbsag-hccag融合表达细胞系的建立论文

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1、HBsAg/HCcAg融合表达细胞系的建立论文.freelericplasmidCSpcDNA3.1includingHBVSgeneandHCVCgene.Clones-iteddilution.HBVSgeneandHCVCgene-munofluorescentassay.RESULTSTranscriptionofHBVSgeneandHCVCgeneed.HBsAgandHCcAgega公司.RPMIMedium1640培养基、HBV表面抗原单克隆抗体、HCV核心蛋白单克隆抗体及荧光标记的羊抗鼠单克隆抗体均购于华美生物工程公司.电穿孔仪（GenePulserⅡElec

2、troporationsystem）为BIO-RAD公司产品.1.2方法1.2.1G418浓度与电穿孔参数的选择在六孔板上培养p815细胞，待铺满板底25%面积时，加入G418，六孔终浓度分别为0，200，300，400，500，600mgL-1，观察细胞成活率，2～3L1×HEBESpH7.3洗涤1次，沉淀重悬于2mL1×HEBES液中，取2份0.8mL于2个电穿孔杯中，分别加入线性化质粒CSpcD-NA3.1和pcDNA3.1，于4℃冰箱10min.电传条件950μF，230V和17.0ms.电穿后移入六孔板，加2.2mL100mLL-1RPMI1640培养液混匀，G418

3、终浓度为400mgL-1.2～3RNA的检测Trizol法提取RNA后，用DNaseⅠ处理RNA样品.RT-PCR参照AMVReversetranscriptionKIT说明书进行.1.2.5HBsAg和HCcAg的检测培养上清用ELISA方法检测，培养细胞用免疫荧光法检测.收集细胞，调整细胞密度为5×109L-1，各取40μL细胞悬液加入两个小玻璃管内，再加抗HBsAg或抗HCcAg的抗体和1∶20稀释的正常兔血清50μL，4℃30min;用DPBS洗涤2次，1000rmin-1离心5min，弃上清，加入1∶10稀释的羊抗鼠荧光标记物50μL和1/104的伊文蓝2μL，4℃3

4、0min;同上离心洗涤，加100μL固定液，制片后在荧光显微镜下观察.转染pcDNA3.1的阴性细胞对照检测方法同上.2结果2.1G418最适浓度和最佳电传孔条件600和500mgL-1孔于第2日，400和300mgL-1孔于第3日，200mgL-1于第5日开始分别出现抑制现象，细胞开始溶解.其中300mgL-1和400mgL-1两孔培养细胞分别在第18日和第16日全部死亡，为克隆筛选的最适G418浓度.p815细胞经电穿孔后，过夜后观察活细胞计数，80%细胞死亡的电传条件为950μF，230V和17.0ms，为最佳电传孔参数.2.2G418筛选结果G418筛选转染的p815细

5、胞，3s.转染质粒是闭环、超螺旋还是线性化转染效率高，说法不一.我们参照电传孔转染方法说明书，把重组质粒CSpcD-NA3.1用建议的BglⅡ酶切，使之线性化，转染细胞经G418筛选3age:Adualroleforthevirus-specificcytotoxicTlymphocyteresponseinhepatitisBandCinfection［J］.CurrOpinMicrobiol，2000;3（4）:387-392.［2］Bohmethods，1996;193（1）:29-40.［3］EnckeJ，PutlitzJ，olImmunol，2001;17（3）:23

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