hbv源性microrna前体分子预测

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1、HBV源性MicroRNA前体分子预测【关键词】肝炎病素乙型微RNAs预测0引言　　MicroRNA是一类21～23nt长的非编码单链小分子RNA，是由priRNA分子经过剪切成为70～90个碱基大小、具有发卡结构单链RNA的前体（premiRNA），再经Dicer酶加工生成［1］.MicroRNA广泛存在于真核生物中，迄今为止在人体中已经发现了至少320种MicroRNA分子.MicroRNA通过与mRNA的3′非编码区相互作用调控基因表达，在机体的生理及病理过程中发挥重要作用.最近研究表明，一些病毒的基因组，如疱

2、疹病毒、腺病毒、HIV，也能编码MicroRNA［2］.HBV基因组能否编码MicroRNA分子目前还不清楚.本研究中，我们借助于预测软件VMir，对HBV全基因组进行正反两个方向的扫描，寻找HBV基因中编码microRNA前体分子，对HBV编码的microRNA分子进行初步预测，并通过Northernblot实验对其进行初步鉴定.1材料和方法1.1材料预测软件VMir由加利福尼亚大学GrundhoffAT教授惠赠.HBV全基因序列检索自Genebank，序列号为NC_003977，adr型.HepG2和HepG2.2.

3、15细胞均购自ATCC.HepG2细胞培养选用含100mL/L胎牛血清（Hyclone）RPMI1640培养液（Gibco）.HepG2.2.15细胞选用含相同血清浓度的培养液，另外加入终浓度380mg/L的G418(Sigma).上述两种细胞均在37℃的含50mL/LCO2孵箱中培养.Trizol购自Invitrogen公司.Northenblot所用尼龙膜购自Ambion公司.［γ32P］ATP购自北京福瑞生物工程公司.1.2方法1.2.1预测软件VMir工作原理VMir是由GrundhoffAT等［3-4］创建的

4、一种病毒编码MicroRNA前体分子预测方法.工作原理为：病毒基因序列以500nt为一个窗口，10nt递进扫描；RNAfold算法预测窗口内的发卡结构；限定发卡结构长度，按照以下规则评分：每个互补的碱基对奖励2分；末端环状结构超过17个碱基时，每超一个，减1分；对于对称性隆起，减去碱基数×1(碱基数≤4)或碱基数×1.5(碱基数﹥4)；对于非对称性隆起，减去碱基数×2.经上述处理，每个发卡结构得到一基数，再乘以系数Ip得到最终分值.再进一步限定分值及其窗口出现频率（一般限定最低分值为115,窗口值即在不同窗口中出现的频率

5、为35，因在该条件下成功预测概率为98%［4］）,最终得到病毒基因编码的microRNA前体分子.该方法已经成功预测出KSHV（卡普西肉瘤相关病毒）、EBV（EB病毒）等编码的microRNA前体分子.1.2.2利用VMir预测HBV编码的microRNA前体分子将HBV全基因序列(NC_003977)导入VMir软件，设定窗口大小为500nt，递进单位为10nt，发卡结构长度设为100nt，对HBV基因组中能够形成发卡结构的序列进行初筛.然后，设定以每个序列最低得分为115,其窗口值最低为35,得到HBV可能编码的mi

6、croRNA前体分子.1.2.3预测前体分子的初步验证我们选用Northernblot方法对经VMir软件筛选到的候选分子进行初步验证.所用探针序列为候选microRNA分子的反相互补序列，用T4多聚核苷酸激酶末端标记放射性标记γ32P.以稳定表达HBV的HepG2.2.15为研究对象，以HepG2细胞作为对照，按照试剂说明书，利用Trizol试剂提取总RNA.取40μg总RNA进行150g/LTBE尿素凝胶电泳；再经半干转运至尼龙膜后，利用上述标记探针杂交、放射自显影.如果经VMir预测到的候选分子是HBV基因编码的

7、microRNA前体分子，那么来自于HepG2.2.15细胞的总RNA与探针杂交后，应出现两条特异性的条带：分子量较大的一条为microRNA前体分子，较小的一条为成熟的microRNA分子.因为microRNA前体分子在Dicer酶作用下产生成熟的microRNA分子，而剩余的核苷酸将迅速被降解，故一般只有两条特异性条带.而于HepG2细胞的总RNA与探针杂交后则没有特异性条带产生.2结果2.1HBV基因组中microRNA前体分子预测将HBV基因序列导入VMir软件后，设定窗口大小为500nt，以10nt为递进单位，

8、寻找HBV基因中的发卡结构序列.共查找到56个寡核苷酸分子，其中在正向序列中有25条（MD1～25）,反向序列31条（MR1～31）.然后分别设定窗口值和最低分值为35和115，筛选出HBV最有可能编码的microRNA分子前体序列，最终得到了三个候选分子，即MD6,MD17和MR31(表1).上述3个序列经RNAf