cas9的研究进展

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1、Cas9的研究进展　　基因打靶技术是上世纪80年代新兴的一种通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的一项新型分子生物学技术。但是传统的基因打靶效率低，一般在110-6以下，特别是对于没有干细胞建系的大型的哺乳动物效率更低。因此，自然条件下的基因打靶很难成功的实现。随着分子生物学技术的发展，锌指人工核酸酶(zincfingernuclease，ZFN)的应用，使得基因打靶效率较传统的基因打靶成功率得到提高。ZFN能识别特异的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，DNA

2、)序列，并在此特异位点产生一个DNA双链切口，而后由细胞固有的DNA修复机制通过同源重组或非同源末端连接将切口修复，使基因打靶效率提高了3～5个数量级，而且具有极高的特异性，从而达到DNA靶向修饰的目的。　　此后，相继出现了比ZFN更有前景的类转录激活因子样效应物核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectorsnuclease，TALEN)和规律成簇的短回文重复序列(clusteredregularlyintespacedshortpalindromicrepeats，CRISPR)。但是，在三种人工核酸酶中

3、，ZFN具有脱靶切割导致的细胞毒性及上下文依赖效应和设计繁琐等缺点;TALEN的分子量较大，构建复杂、成本高，而且易增加操作过程中的难度等不利因素;而由RNA来引导的CRISPR/Cas9具有ZFN和TALEN所不具有的优点，如可以同时一次性敲除多个数量的单个基因、具有优良的靶向性、打靶成功率高于TALEN和ZFN，而且构建简单、成本低等。故CRISPR/Cas9技术自2013年首次应用以来，就迅速的被广大中外研究人员接受而广泛应用于研究中，成为当今生命科学技术研究的新热点。　　1CRISPR/Cas9介导基因打靶的工作原理　　CRISPR

4、/Cas9结构包括三大部分:5'端的反式激活核糖核酸(trans-activatingribonucleicacid，tracrRNA)基因;中间部分的Cas蛋白结构基因和3'端的CRISPR基因座。由这三部分表达出的tracrRNA和crRNA组成RNA二聚体，然后与Cas9蛋白结合后识别切割靶位点。切割后细胞启动自身的修复机制，一类是非同源末端连接修复，能够导致基因敲除;另一类是当提供供体DNA作为供模板时，细胞就会启动HR修复机制，实现基因片段的插入，当需要做一个点突变和小片段的缺失或插入时，需要一条可达200bp的单

5、链寡聚脱氧核糖核苷酸链模板，当需要做一段较大片段的基因的插入时，供体DNA就必须是一个含有待插入的目的基因和两端同源臂的双链DNA质粒。　　2CRISPR/Cas9的构建　　CRISPR/Cas9是由一条RNA来引导Cas9去切割靶DNA，所以，CRISPR/Cas9设计就只需设计一条引导RNA去识别并结合靶DNA，然后引导Cas9蛋白去切割DNA即可。　　2.1引导RNA设计在CRISPR/Cas9的构建中，引导RNA设计是关键，决定CRISPR/Cas9的活性和基因编辑的成败。引导RNA由tracrRNA和crRNA组成的RNA二聚体，

6、二聚体的5'端为与靶DNA互补序列互补，3'端序列与Cas结合;早期设计中，将tracrRNA和crRNA单独表达，设计成两条独立的RNA链，但在实验过程中发现，容易产生错配和脱靶效应;随后，为了减少脱靶效应，将tracrRNA和crRNA融合成一条链即单导向核糖核苷酸(singleguideRNA，sgRNA)。这种由一条RNA来引导的Cas9切割靶DNA，可降低脱靶效应的概率，而且还加快靶DNA的切割速度。　　2.2靶序列的选择在靶序列选择时，首先要选择下游含有PAM的序列。通过定性和定量的方法系统地研究了PAM对CRI

7、SPR/Cas9基因编辑的影响，得出结论是NGG、NGA、NAG这三种PAM结构都能与Cas9有效地结合，并且介导切割效率依次是NGG>NGA>NAG。2.3Cas9的靶向运输在设计好引导RNA后，就可以将引导RNA(目前一般为sgRNA)和Cas9蛋白导入生物组织或者培养的细胞中。通常可通过电穿孔、慢性病毒载体转染、脂质体介导等方法转染细胞;对真核细胞基因组DNA编辑时，Cas9的N或者C端新增加一段核定位信号NLS，指导Cas9进入细胞核，能够提高基因组编辑效率。　　3CRISPR/Cas9的研究进展　　CRISPR结构从发

8、现到功能的确定共经历了20多年的时间，科学家在研究细菌进化过程中，发现细菌在长期的进化过程中，往往通过各种各样的策略来使自己适应各种环境，而在基因水平上，细菌能获得新的外源基因促