Cas9技术敲除拟南芥IAA2基因

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1、选Hereditas(Beijing)2016年8月，38(8)：756-764WWW．chinagene．ca研究报告快速构建多重sgRNA载体利用CRISPR／Cas9技术敲除拟南芥IAA2基因刘丁源，邱婷，丁晓辉，李苗苗，朱睦元，王君晖浙江大学生命科学学院，杭州310058摘要：doleAceticAcid2)是拟南芥Aux／IAA生长素响应基因大家族中的一员，目前还没有它的突变体的报道，阻碍了对其功能和作用机制的深入研究。在CRISPR／Cas9基因组编辑技术中，1个sgRNA只能靶向基因的1个位点，有时基因敲除的效率并不高。为了提高

2、敲除效率，本文在Golden—Gate克隆技术的基础上，通过两轮PCR扩增，将每3个sgRNA串联到同1个入门载体中，再将2~1'1载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变。与单个sgRNA相比，多重sgRNA的基因敲除效率高、种系突变多；与其他构建多重sgRNA载体的方法相比，本方法具有快速、高效等优点。本文所得到的5个突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料。关键词：CRISPR／Cas9；多重sgRNA串联；基

3、因组编辑；]AA2基因RapidconstructionofmultiplesgRNAvectorsandknockoutoftheArabidopsisIAA2geneusingtheCRISPR／Cas9genomiceditingtechnologyDingyuanLiu，TingQiu，XiaohuiDing，MiaomiaoLi，MuyuanZhu，JunhuiWangCollegeofLifeSciences，ZhejiangUniversity，Hangzhou310058，ChinaAbstract：lAA2isamember

4、oftheAux／IAAauxinresponsivegenefamilyinArabidopsisthaliana．Noiaa2mutanthasbeenreporteduntilnow,thushinderingitsfurthermechanisticinvestigations．ThenormalgenomiceditingtechnologyofCRISPR／Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats／CRISPR—associatedprotein9)uses

5、onlyasin·gleguideRNA(sgRNA)totargetonesiteinaspecificgene，andthegeneknockouteficiencyisnothigh，Instead，multiplesgRNAscantargetmultiplesites；therefore，theeficiencymaybeimproved．Inthepresentinvestigation，weusedthegol-den-gatecloningstrategyandtworoundsofPCRreactionstocombinet

6、hreesgRNAsinthesameentryvector．ThefinalexpressionvectorwasobtainedbyLRreactionswiththedestinationvectorcontainingtheCas9expressioncassette．FouroutofthesixsgRNAswereefective，andwealsoobtainedalotofinsertionanddeletionmutations．ComparedwithonesgRNAapproach，multiplesgRNAsdispl

7、ayedhighergene—knockouteficiencyandproducedmoregerm—linemutants．Thus，收稿日期：2016-01-04；修回日期：2016-02-16基金项目：国家自然科学基金项目(编号：31170211)和浙江省科技计划项目(编号：2012C12902)资助[SuppoaedbytheNationalNaturalScienceFoun-dationofChina(No．31170211)andScienceandTechnologyResearchProjectsofZhejiangPro

8、vince(No．2012C12902)]作者简介：刘丁源，硕士研究生，专业方向：遗传学。E．mail：dingyuan0726@126．com通讯作者：王君晖，副