最新CRISPR cas9 技术资料.ppt

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1、划时代的靶向基因操作技术CRISPR/Cas9__________________________________________________无论研究什么生物现象，都需要做一件事：改变基因1）Lossfunction：降低基因或删除基因Givefunction:提高基因的表达__________________________________________________划时代的基因靶向操作技术：CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦!!!经典基因操作：Genetrap:化学诱变；转座子--------海量的筛选+goodLuck同源重组：一般物种几率低,10-6；EScell10-

2、2难！突破性的发现：RNAi-Knockdown;不完全敲除，临时性充满梦想却幻灭的ZFN：难以完全找到匹配的3连子锌指；Off-target严重美国加州大学DaveSegal教授说：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”完美基因靶向操作：识别特异DNA序列+操作DNA的酶__________________________________________________细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA来识别并进行有效的靶向DNA剪切。CRISPR/Cas9SystemCl

3、usteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat成簇的规律间隔的短回文重复序列.SorekR.etal.NatRevMicrobiol.2008，6(3):181-186__________________________________________________CRISPR/Cas9作用机理BarrangouR.NatureBiotech.2012:30,836–838PAM：protospaceradjacentmotifs前间区序列邻近基序，2–4nt；TypeIITypeITypeIIICas9+sgRNACRISPR/Cas9

4、RGN__________________________________________________CRISPR/Cas9应用__________________________________________________1、载体的构建原生质体愈伤组织植株转染sgRNA：Cas9质粒筛选基因敲除的愈伤组织__________________________________________________Fig1.SchematicillustratingtheengineeredtypeIICRISPR-Cassystem._____________________________

5、_____________________Table1.Targetlociandtargetsequencesofthemutations2、突变频率的检测__________________________________________________等位基因突变的检测Fig2.sgRNA:Cas9-inducedOsPDS-SP1mutationsintransgenicriceplants.__________________________________________________WT_____________________________________________

6、_____3、同源重组修复（HDR）的检测Fig4.PCRamplificationoftheprotoplastgenomicDNApredigestedwithPstItoenrichforsgRNA:Cas9-inducedmutations.Fig3.SchematicoftheoligotargetingsiteinOsPDS.__________________________________________________Fig5.TargetedintegrationoftheKpnIandEcoRIrestrictionsites._____________________

7、_____________________________SpecificityandOff-targetFig7a.On-targetandpotentialoff-targetsequences.经过相关酶切和测序，在PDS_NI-1和MPK2_NI-2两种类型的的同源序列中，并没有发现sgRNA:Cas9诱导的突变体。___________________________________________