【5A文】CRISPR技术最新总结.pptx

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1、CRISPR-Cas9技术的原理及其应用汇报人：时间：2016年11月SouthChinaNormalUniversity汇报提纲基因编辑技术的发展史CRISPR/Cas9编辑技术CRISPR/Cas9编辑技术的原理CRISPR/Cas9的应用CRISPR/Cas9的研究现状一、二、三、四、五、一、基因编辑技术的发展史基因打靶(Genetargeting)寡聚DNA/RNA介导的修复锌指酶TalenCRISPRNgAGO？CRISPR/Cas9（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromic

2、Repeats-成簇的规律间隔的短回文重复序列）是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。二、CRISPR/Cas9编辑技术WHATWHORuud.Jansen2002年，荷兰乌得勒支(Utrecht)大学的Ruud.Jansen在Molecularmicrobiology杂志上发表了题为Identificationofg

3、enesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes的文章，他们利用生物信息工具对一系列古菌和细菌的重复序列进行了分析。文章中，Jansen等人在Mojica的协商下，首次将这个重复序列命名为ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats,简称CRISPR，这就是我们现在所通用的名称。CRISPR/Cas9编辑技术的发现CRISPR/Cas系统是一种原核生物的免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒和外源质粒。同时，它为细

4、菌提供了获得性免疫：这与哺乳动物的二次免疫类似，当细菌遭受病毒或者外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，从而可以抵抗它们的再次入侵。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。这与真核生物中RNA干扰（RNAi)的原理是相似的。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统被开发成一种高效的基因编辑工具。三、CRISPR/Cas9基因敲除原理HOWCRISPR序列结构位点有什么特点？CRISPR序列由众多短而保守的重复序列区（repeat）和间隔区（spacer）组成。重复序列区含有回文序列，

5、可以形成发卡结构。而间隔区比较特殊，它们是被细菌俘获的外源DNA序列。而在上游的前导区（leader）被认为是CRISPR序列的启动子。另外，在上游还有一个多态性的家族基因，该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用。因此，该基因被命名为CRISPR关联基因（CRISPRassociated，Cas）。目前已经发现了Cas1-Cas10等多种类型的Cas基因。Cas基因与CRISPR序列共同进化，形成了在细菌中高度保守的CRISPR/Cas系统。CRISPR序列是如何与Cas蛋白配合来执行防御功能的呢？第一步：外源DNA俘

6、获当噬菌体病毒首次入侵宿主细菌，病毒的双链DNA被注入细胞内部。CRISPR/Cas系统会从这段外源DNA中截取一段序列作为外源DNA的“身份证”，然后将其作为新的间隔序列被整合到基因组的CRISPR序列之中。因此，这段与间隔序列对应的“身份证”被称为原间隔序列（protospacer）。然而，“身份证”的选取并不是随机的。原间隔序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，被称为原间隔序列临近基序（protospaceradjacentmotif，PAM）。PAM通常由NGG三个碱基构成（N为任意碱基）。病毒入侵时，Cas1和Cas2编码的蛋

7、白将扫描这段外源DNA，并识别出PAM区域，然后将临近PAM的DNA序列作为候选的原间隔序列。随后，Cas1/2蛋白复合物将原间隔序列从外源DNA中剪切下来，并在其他酶的协助下将原间隔序列插入临近CRISPR序列前导区的下游。然后，DNA会进行修复，将打开的双链缺口闭合。这样一来，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。第二步：crRNA合成目前的研究表明，CRISPR/Cas系统共有三种方式（TypeⅠ、Ⅱ、Ⅲ）来制造”军火“。CRISPR/Cas9系统属于TypeⅡ，是目前最成熟也是应用最广的类型。因此，下图将重

8、点介绍CRISPR/Cas9的原理。当入侵者到来，CRISPR序列会在”指挥官“（前导区）的调控下转录出两种“军火材料”：pre-CRISPR-derivedRNA(pre-crRNA)和trans-actingcrRN