【5A版】基因编辑方法CRISPR-Cas9.pptx

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1、CRISPR-Cas9一种新型基因编辑方法又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。方法包括：锌指核酸酶（Zinc-fingernuclease，ZFN）技术转录激活因子样效应物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）技术Cas9/gRNA系统(CRISPR-cas9技术)基因组编辑技术Cell2014157,1262-1278Figure2B不论是TALEN技术还是ZFN技术，其定向打靶都依赖于DN

2、A序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位，DNA切割域剪切。锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术Cell2014157,1262-1278Figure2ACRISPR-Cas9技术原理：规律性重复短回文序列簇（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs）CRISPR-Cas系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根据CR

3、ISPR-Cas系统的特性对此系统进行改造产生了第3代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的RNA介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、降解。CRISPR-Cas9技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编码工具。Cell2014157,1262-1278Figure4CRISPR-Cas9技术从已知的序列中通过PAM进行定位寻找合适的靶位点并合成gRNA构建gRNA与/Cas9重组质粒。对重组质粒进行活性检测，敲除活性的计算挑选活性较高的敲除质粒导入培养的细胞或者生物体

4、内进行基因组定点编辑操作利用测序、RFLP等方法检测基因组定点修饰结果sgRNA的设计选择PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列，即敲除的靶位点。(PAM，Protospaceradjacentmotifs原间隔序列临近基序。一般形式为NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA序列中)原则：选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。优先选择DSB位点的侧翼存在重复序列（如果DSB的侧翼存在重复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导

5、断裂位点碱基的缺失）。PAM的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）构建重组质粒构建方案：一是将gRNA与Cas9连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选）。二是将gRNA与Cas9分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性基因载体选择：慢病毒载体以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。gRNA的活性检测限制性内切酶法当Cas9/sgRNA靶点位置中间序

6、列存在限制性内切酶切位点时，如果通过Cas9/sgRNA发生突变，这个位点将可能被破坏，而不能被内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量sgRNA的活性。非配对内切酶法T7核酸内切酶I（T7endonucleaseI，T7E1）能够识别不完全配对DNA并对其进行切割，如果通过Cas9/sgRNA发生突变，将基因组DNA做PCR，将相对应的PCR产物与野生型DNA的PCR产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对DNA片段，将能被非配对内切酶T7E1剪切。用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量sgRN

7、A的活性。SSA活性检测一个终止子插入luciferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP）就会失去活性。为检测Cas9/sgRNA剪切活性，将一个Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/sgRNA的作用下，靶点位置产生DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活性的luciferase。通过与对照组的比值变化就可反应Cas9/sgRNA剪切的活性水平。降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚基

8、的失活都将形成DNA单链断裂（nickedDNA）。当结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9D10A识别并切割靶位点时才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性。Cell2014157,1262