【5A版】三种基因编辑工具.pptx

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1、基因编辑技术—ZFN、TALEN、CRISPR/Cas20141210wing基因编辑的三大利器ZFN(Zinc-fingernucleases,ZFN)TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）特异性DNA识别域非特异性核酸内切酶+2ZFN原

2、理ZFN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA。TALENTALE（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关

3、系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。4TALEN原理TALEN=DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般20个左右），每个TAL蛋白识别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA5全长为34aa的Tal蛋白的第12、13位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基。NG可

4、以识别THD可以识别CNI可以识别ANN可以识别G或A通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组装在一起，再加上FokI核酸内切酶，就可以构成可以识别目的片段的Tale蛋白。TALEN原理6TALEN的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的TALE，定位到需要编辑的基因组区域；然后非特异性核酸内切酶FokI切断双链DNA从而造成DNA双链断裂（double-strandbreak，DSB）；再通过DNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性

5、。TALEN原理7TALEN介导的基因编辑TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。TALEN的技术特点任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上打靶效率高，可完全替代RNAi技术脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应周期短，只需按照常规构建质粒方法构建Talen

6、质粒9CRISPR/Cas系统CRISPR序列：细菌和古细菌中发现的很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsequences）。Cas：CRISPR相关基因（CRISPR-associatedgenes）CRISPR-Cas系统是细菌的免疫系统：CRISPR序列能特异性识别外源核酸序列；Cas蛋白的非特异性核酸内切酶功能将外源核酸切断。10CRISPR/cas系统的发现1987年发现苗头：大阪大学研

7、究者对一种细菌碱性磷酸酶基因研究中发现，其基因编码区域附近存在一小段简单重复的DNA序列片段，但不太清楚其生物学意义。随后十年不断确认：约40%细菌和90%古细菌基因末端，有多组DNA序列+反向序列+约30bp随机序列（spacerDNA）。这种由多组重复片段和空格片段组成的成簇的、规律间隔的短回文重复序列，被称为CRISPR（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats）。2005年提出假说：3个生物信息学课题组报道，CRISPR中空格D

8、NA能与噬菌体DNA序列互补匹配。假说：提示细菌可能CRISPR序列可能与细菌的免疫保护机制相关，可能细菌通过获得噬菌体DNA，转录形成RNA后与入侵的外源DNA结合，起到类似RNA干扰的作用。112007年实验验证：Danisco公司的Barrangou和Horvath等发现，通过插入或删除嗜热链球菌（乳酸菌）中几个与噬菌体序列互补的空格DNA片段，就可以改变细菌对噬菌体的免疫力。（Science,23,2007,p1650）德国学者机制研究：Helmholtz、D