基因编辑方法.ppt

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1、CRISPR-Cas9一种新型基因编辑方法又称基因组定点修饰技术，通过在某些物种基因组中进行靶向特异性的突变，从而解答并提出更多精确的生物学问题。方法包括：锌指核酸酶（Zinc-fingernuclease，ZFN）技术转录激活因子样效应物核酸酶（Transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN）技术Cas9/gRNA系统(CRISPR-cas9技术)基因组编辑技术Cell2014157,1262-1278Figure2B不论是TALEN技术还是

2、ZFN技术，其定向打靶都依赖于DNA序列特异性结合蛋白模块的合成,将蛋白模块与限制性内切酶(FokⅠ)的DNA切割域融合而得到。由蛋白特异结合域定位，DNA切割域剪切。锌指核酸酶（ZFN）＆转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术Cell2014157,1262-1278Figure2ACRISPR-Cas9技术原理：规律性重复短回文序列簇（clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPRs）CRISPR-Cas系统是细菌

3、和古细菌在不断进化的过程中获得一种适应性免疫防御机制，研究者根据CRISPR-Cas系统的特性对此系统进行改造产生了第3代人工核酸内切酶技术——CRISPR-Cas9技术。该技术通过小片段的RNA介导对入侵的核酸进行靶向定位并通过Cas酶对核酸进行酶切、降解。CRISPR-Cas9技术是一种多物种适应性的，位点特异性的有效基因组编码工具。Cell2014157,1262-1278Figure4CRISPR-Cas9技术sgRNA的设计选择PAM（NGG）5‘端的一段碱基序列20nt作为原间隔序列

4、，即敲除的靶位点。(PAM，Protospaceradjacentmotifs原间隔序列临近基序。一般形式为NGG，其作用是将间隔序列定位于入侵的噬菌体或质粒的DNA序列中)原则：选择的序列必须在全基因组中进行比对，原间隔序列必须唯一，否则会对其他基因进行敲除而出现错误的实验结果。优先选择DSB位点的侧翼存在重复序列（如果DSB的侧翼存在重复序列，在进行非同源末端重组时能够精确的介导断裂位点碱基的缺失）。PAM的5‘端尽量存在酶切位点。（有利于后期的活性检测）构建重组质粒构建方案：一是将gRNA

5、与Cas9连入同一个质粒载体中并以双启动子启动，载体中携带荧光报告基因（用于流式细胞仪筛选）或抗性基因（用于药物筛选）。二是将gRNA与Cas9分别连载不同的载体上，两个载体携带有不同的荧光报告基因或抗性基因载体选择：慢病毒载体以HIV-1的主要功能元件为基础构建起来的转基因和基因治疗载体。区别于腺病毒载体，可实现外源基因在目标细胞内稳定的传代表达。gRNA的活性检测限制性内切酶法当Cas9/sgRNA靶点位置中间序列存在限制性内切酶切位点时，如果通过Cas9/sgRNA发生突变，这个位点将可能

6、被破坏，而不能被内切酶酶切。可采用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量sgRNA的活性。非配对内切酶法T7核酸内切酶I（T7endonucleaseI，T7E1）能够识别不完全配对DNA并对其进行切割，如果通过Cas9/sgRNA发生突变，将基因组DNA做PCR，将相对应的PCR产物与野生型DNA的PCR产物等量混合，并退火杂交，将产生非配对DNA片段，将能被非配对内切酶T7E1剪切。用电泳的方法估计突变效率，以突变效率的高低来衡量sgRNA的活性。SSA活性检测一个终止子插入luci

7、ferase（GFP）的编码区中央，luciferase（GFP）就会失去活性。为检测Cas9/sgRNA剪切活性，将一个Cas9/sgRNA的靶点位置序列插在终止子后。在Cas9/sgRNA的作用下，靶点位置产生DSB，细胞通过同源重组方式修复DNA，形成一个有活性的luciferase。通过与对照组的比值变化就可反应Cas9/sgRNA剪切的活性水平。降低sgRNA/Cas9脱靶率的方法Cas9的两个内切酶活性域为RuvC和HNH,两个亚基分别负责对一条DNA单链的切割。任一亚基的失活都将形

8、成DNA单链断裂（nickedDNA）。当结合于两条互补的DNA链上相邻位置的一对sgRNA同时引导Cas9D10A识别并切割靶位点时才能造成DSB，从而加大了识别的长度，有效的提高了Cas9-sgRNA技术的特异性。Cell2014157,1262-1278Figure6A,B重组质粒导入细胞/生物体C、将编码Cas9和sgRNA的表达质粒直接转染至细胞系中。D、将纯化的Cas9和体外表达的sgRNA显微注射至受精卵，快速得到转基因动物模型。E、将编码CRISPR组分的高效价的病毒载体转导至组