基因编辑技术

《基因编辑技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、基因编辑技术一、概念基因编辑是近年来发展起来的可以对基因组完成精确修饰的一种技术，可完成基因定点InDel突变、敲入、多位点同时突变和小片段的删失等，可在基因组水平上进行精确的基因编辑。二、应用1.在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；2.在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，如改良水稻等粮食作物；3.在医疗领域，基因编辑技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机理和探究基因功能，可以改造人的基因，达到基因治疗的目的等。三、作用机理基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径（NHEJ）修复和同源重组（HR）修复，联合特异性DNA的靶向识别及核

2、酸内切酶完成的DNA序列改变。注：非同源末端连接（Non-homologousEndJoining-NHEJ)是真核生物细胞在不依赖DNA同源性的情况下，而为了避免DNA或染色体断裂（Breaks)的滞留，避免因此造成的DNA降解或对生命力的影响，强行将两个DNA断端彼此连接在一起的一种特殊的DNA双链断裂修复机制。同源重组（HR）修复即双链DNA中的一条链发生损伤，在DNA进行复制时，由于该损伤部位不能成为模板，不能合成互补的DNA链，所以产生缺口，而从原来DNA的对应部位切出相应的部分将缺口填满，从而产生完整无损的子代DNA的这种修复现象。四、类别ZFN、TALEN、CRISPR/C

3、as9是三大基因编辑技术，这三种编辑工具的共同点是：含有靶点DNA序列的识别区域及DNA剪切功能区域。1.ZFN技术具有锌指结构域能够识别靶点DNA2.TALEN的DNA识别区域是重复可变双残基的重复，DNA剪切区域都是一种名为Fokl的核酸内切酶结构域3.CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切四、传统技术的优缺点1.ZFN 的基因打靶效率能够达到30%左右，已经可以做到针对某些特定的序列来设计ZFN实现靶基因的修饰，但也有其发展的局限性，ZFN 的识别结构域中存在上下文依赖效应，使得 ZFN设计和筛选效率大大降低，所以目前尚无法实现对任意一段

4、序列均可设计出满足要求的 ZFN，也无法实现在每一个基因或其他功能性染色体区段都能够顺利找到适合的 ZFN作用位点，并且在已经成功运用的 ZFN的报道中，大多数研究者并不公布其 ZF 序列。所以，在 ZFN的筛选和设计方面还存在较大技术困难。另外，由于 ZFN的脱靶切割会导致细胞毒性，使得其在基因治疗领域的应用出现了一定的局限性。1.相比 ZFN技术，TALEN 使用了 TALE 分子代替 ZF 作为人工核酸酶的识别结构域，极好地解决了 ZF 对于 DNA 序列识别特异性低的问题。TALE蛋白与 DNA 碱基是一一对应的，并且对碱基的识别只由 2 个氨基酸残基决定，这相对于ZFN的设计要

5、简单得多。但是在构建过程中，TALE 分子的模块组装和筛选过程比较繁杂，需要大量的测序工作，对于普通实验室的可操作性较低，而商业化公司构建也需要花费上千美元，使用成本较高； 2.3）相较于 ZFn 和 TALEN 两种人工核酸酶技术，CRISPR/Cas9 系统是一个天然存在的原核生物 RNA干扰系统，其介导的基因组编辑是由 crRNA 指导的，对靶序列的识别是 RNA 与 DNA 的碱基配对过程，相比蛋白质对 DNA 序列的识别要精确更多，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。而且 CRISPR/Cas9 的构建仅仅需要设计与靶序列互补的 RNA 即可，过程相对于 TALEN 更为简单

6、和廉价，普通的实验室也可以自行完成构建，这大大提高了基因操作的效率及简便性。但是，CRISPR/Cas9 系统也存在着一些不足。首先，Cas9 蛋白对于目标序列的切割不仅仅依靠 crRNA 序列的匹配，在目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序 (PAM)，如果目标序列周围不存在 PAM或者无法严格配对，则 Cas9 蛋白不能对任意序列进行切割。最后，和 ZFN 及 TALEN 技术一样，CRISPR/Cas9 也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能随机产生细胞毒性的问题。四、技术的新发展2014年10月29日，Nature杂志上发布了名为” Promoterless

7、 gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”的研究论文，据悉，该文章发布了一种超越CRISPR的基因组编辑新技术，而CRISPR技术在今年被《Nature Methods》评为在过去十年中对生物学研究影响最深的十大技术之一。新方法不需要内切酶在特异位点剪切DNA，也不需要使用启动子，大大降低了新基因自身插入到基因组中随机位置而引起癌症的机会。