【8A文】CRISPR基因编辑技术.ppt

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1、基因组编辑技术姓名：学号：自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。1973年，斯坦利·N·科恩(StanleyN.Cohen)和赫伯特·W·博耶(HerbertW.Boyer)成功将蛙的DNA插入到细菌中。20世纪70年代，基因泰克(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。1974年，，加利福尼亚州索克生物研究所(SalkInstituteforBiologicalStudies)的RudolfJaenisc

2、h通过将SV40病毒的DNA注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只转基因小鼠。基因突变技术：物理诱变、化学诱变…转基因技术：T-DNA插入RNA干扰技术：dsRNA、ArtificialmiRNA核外遗传技术：质粒、人工染色体同源重组技术：e.g.传统的基因敲除小鼠无法控制突变位点不能精确控制外源基因插入位点对靶基因抑制不彻底、不特异难以稳定的遗传费时费力费钱，难以大量应用并引起一系列生物伦理的问题…现状基因组编辑技术基因组编辑技术（genomeediting）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶（Gen

3、etargeting）。技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。历史1993年前ZFN就已开始出现，迄今已发展了20多年才有今天的成就；2009年底出现的TALEN似乎一夜之间呈现出取代ZFN的架势；2012年底CRISPR/Cas已显现出取代TALEN的巨大潜力，在2013年成为现实。荣誉2011年：ZFN，TALEN和Meganuclease—2011年度方法（NatureMethods）2012年：TALEN—2012年十

4、大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。基因组编辑技术应用基因组巡航导弹，分子剪刀，DNA外科医生定点突变，定点修饰（包括得到转基因），转录调控基因治疗（如遗传病）基因编辑的三大利器ZFN(Zinc-fingernucleases,ZFN)TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrep

5、eat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）特异性DNA识别域非特异性核酸内切酶+8ZFN原理ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。9核酸内切酶：非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链DNA两条ZFN之间具有被称为“间隔区”的spacer结构，该结构的长度以5～6bp为宜，7bp也能正常工作，合理的“间隔区”设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳的工作空间

6、。ZFN技术的缺陷DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其识别的序列长度比较有限。因为ZFN剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应；如果出现脱靶，可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相关基因突变，引发癌症等。ZFN作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻

7、。到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作（invitro），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。TALENTALEN（Transcriptionactivator-likeeffectors）:一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.(黄单胞菌)的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马

8、鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。TALEN原理典型的TALEN由一个包含核定位信号（NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个