1 引言 人的高迁移率族蛋白1(high mobility group box

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1、1引言人的高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupbox　　1引言　　人的高迁移率族蛋白1(highmobilitygroupbox1,HMGB1)含215个氨基酸残基(aminoacid,aa)。最初发现的HMGB1是一种广泛存在的DNA结合蛋白，它参与DNA的转录、复制、修复以及细胞运动等。HMGB1作为一种细胞因子，是一种重要的晚期炎症介质，是引起败血症的重要原因。HMGB1在多种肿瘤中过表达，其水平远高于相对应的正常组织，且可能与肿瘤的发生发展、病灶大小、浸润及淋巴转移有密切关系。目前，普遍公认的HMGB1结合的膜受体是

2、晚期糖基化终末产物受体（receptorforadvancedglycationendproducts,RAGE）。但研究发现细胞表面可能还存在着其他HMGB1受体，这表明HMGB1作用于细胞可能存在不同的信号转导方式。为进一步研究清楚HMGB1作用于细胞的信号机制，本文章构建了His-SBP-HMGB1融合蛋白表达载体，为下一步通过串联亲和纯化来寻找与HMGB1蛋白相互作用的蛋白提供实验材料，为深入研究HMGB1的细胞信号转导通路机制提供实验工具。　　2材料与方法　　2.1质粒　　pET-14b-SBP-EGFP和pET-14b-HMGB

3、1-EGFP载体、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)均由本室保存。　　2.2主要试剂　　引物由上海英骏生物技术有限公司合成。限制性内切酶(KpnI、XhoI)、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；高保真DNA聚合酶KODplus、100bp和1kbDNAladder分别是Toyobo公司和Axygen公司产品；异丙基-β-D-硫代半乳糖（isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）购自Sigma-Aldrich公司；QIAprepSpinMiniprepKit和Ni2＋-NTA

4、亲和树脂购自Qiagen公司；苯甲磺酰氨(phenylmenthylsulfonylfluoride,PMSF)、TritonX-100和蛋白酶抑制剂混合物（cocktailofproteasesinhibitor）购自美国Sigma公司；青霉素钠、链霉素、EDTA及其他试剂均为进口或国产分析纯。　　2.3pET-14b-SBP-HMGB1重组质粒的构建（fe;CATGGTACCGGCAAAGGAGATCCTAAGAAGC3′（下划线为KpnI位点）；下游引物为5′CCCGCTCGAGTTATTCATCATCATCA

5、TCTTCTTCTTC3′（下划线为XhoI位点）。用高保真DNA聚合酶KODplus进行聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）扩增（反应条件为94℃，15s；56℃，30s；68℃，1min，35个循环），扩增片段大小为645bp。将PCR产物和载体pET-14b-SBP-EGFP分别用KpnI和XhoI双酶切并电泳切胶回收后，用T4DNA连接酶连接，将连接反应混合物转化大肠杆菌株DH5α。　　挑取单菌落接种于Amp+的LB培养基中，37℃振摇过夜。取5ml菌液用QIAprepSpi

6、nMiniprepKit小量提取质粒后，用KpnI和XhoI酶切鉴定。另外使用上述引物对重组体进行PCR鉴定。酶切及PCR鉴定产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶图像分析仪上成像。重组体最终经测序鉴定无误后，置-20℃保存备用。　　2.4His-SBP-HMGB1融合蛋白的原核表达及纯化　　将阳性重组质粒转化大肠杆菌株BL21(DE3)。挑取单菌落，置于2mlLB(Amp+)培养基中，37℃振摇培养至D600约为0.6时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG诱导，继续振摇3h。利用12%SDS-PAGE来鉴定表达融合蛋白的菌落。对高效

7、表达His-SBP-HMGB1融合蛋白的细菌，扩增到500ml体积并进行IPTG诱导。8,000g,4°C离心5min，收集细菌并重悬于8ml结合缓冲液（20mmol/LTris-HCL,500mmol/LNaCl,5mmol/L咪唑，pH8.0）在冰上超声裂解细菌，14,000g，4℃离心30min，收集上清，将上清转入装有Ni2+-NTA亲合树脂的层析柱中，并让其自然流出，然后用5ml结合缓冲液洗去未结合蛋白，再用5ml（1ml/次）冲洗缓冲液（20mmol/LTris-HCL,500mmol/LNaCl,20mmol/L咪唑,

8、pH8.0）洗涤非特异结合蛋白，最后用3ml洗脱缓冲液（20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl,400mmol/L咪唑,pH8.0）洗脱His-SBP-HM