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1、浅论适体技术在临床治疗及药物研究中的应用-->摘要:适体是近年来出现的广泛用于临床治疗研究的核酸之一,具有比抗体和反义核酸优越的性质和特点,极具临床治疗价值,目前正处于初期临床实验阶段,本文对适体在临床治疗研究取得的成果作一综述,并提出相关亟须解决的问题。适体(aptamer),于拉丁语aptus,即“匹配”的意思,又称为适配分子或适配子,实质是运用指数富集的配体系统进化(systematicevolutionofligandbyexponentialenrichmen,tSELEX)技术从人工体外合成的随机寡核
2、苷酸序列库中反复筛选得到的能以极高的亲和力和特异性与靶分子结合的一段寡核苷酸序列,适体可以是RNA、修饰RNA、ssDNA或dsDNA。适体的功能类似于抗体,但具有靶分子范围广、与配体作用亲和力高特异性强、高度稳定性、安全经济、制备方法简单等优点。经过十几年的发展,适体技术开始广泛应用于分子识别、实验诊断、疾病治疗和药物研究。1 适体的筛选过程SELEX过程的基础是先运用DNA化学合成技术建立一个随机序列的寡核苷酸序列库,然后,在一定温度下将随机核酸库与靶分子置于缓冲液中共同孵育,这时,有极小部分序列可与靶分子相
3、互作用,用物理方法(固相亲和层析法或离心法)将这些序列与库中其它序列分离出来,那些不与靶分子结合的序列被冲洗掉,结合序列用PCR方法扩增放大获得一个亲和力增强的核酸库,然后与靶序列在孵育进行下一轮的筛选,经过数轮的筛选与放大,对大多靶分子而言,一般需要8~15轮循环,达到亲和饱和,然后对此时的核酸库克隆测序,获得每一条序列的信息,并根据每一序列与靶分子的亲和力作进一步的定性,一旦序列确定下来,再用化学合成方法大量制备适体。2 适体在临床治疗及药物开发中的应用目前,基因治疗方法主要涉及的核酸包括圈套RNA(Deco
4、yRNA)、核酶及反义核酸等。反义核酸是通过与其互补的mRNA结合从而调控其翻译,调节特定基因的表达和功能,它具有安全性高、设计和制备方便、能直接作用于一些RNA病毒等优点,但是存在专一性转移问题,即如何专一性地对病灶处病变的细胞进行调控,而不影响其它正常细胞。另外,反义核酸注射到体内,易被核酶降解,难以到达靶细胞,有时还可引起较危险的免疫反应[1]。核酶是通过结合到靶RNA分子的适当部位,形成锤头核酶(发夹)结构,通过切断、破坏靶RNA分子达到治疗疾病的目的。适体和圈套RNA都是利用其特殊结构结合并抑制目标蛋白
5、质的活性。适体疾病治疗机制主要是通过折叠成一定的三维结构直接与病理学相关蛋白质特异性结合,抑制这些蛋白质的活性,以达到治疗目的。目前已被广泛运用于病毒感染、癌症、自身免疫病、血管性疾病的临床治疗的研究,并有望成为较为理想的临床治疗的新手段。2•1 病毒感染的治疗2•1•1 适体与获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的治疗:HIV-1逆转录酶(HIV-1RT)的作用是使HIV基因组RNA生成双链DNA,其RNA酶H(RNAH)活性能特异性水解RNA-DNA杂交链上的RNA,RNaSe
6、H具有核糖核酸酶活性,对体内病毒的复制至关重要。Hannoush等[2]设计的RNA适体,呈发夹或哑铃结构,能结合HIV-1RT的RNaSeH的活性域,抑制HIV-1RT的RNaSeH活性,而其它细胞的RNaSeH活性则不受之影响。反式激活蛋白(Tat)是HIV病毒基因组复制和基因表达所必需的反式激活因子,其作用靶序列位于5′端R区内,呈发夹结构。Toulme等[3]筛选了一种对Tat发夹结构有高亲和力的寡核苷酸R06,它与Tat结合的Kd值达到纳摩尔水平,体外实验证明,经2-O-甲基和N3′→P5′DNA氨基磷
7、酸酯化学修饰的的抗-TAR适体在细胞内能与反式激活元件(TAR)竞争结合HIV-1病毒蛋白Ta,t抑制TAR与Tat的结合,抑制Tat介导RNA病毒基因组的复制。R06是适体分子调控真核基因表达的一个很好的例子。Tat和rev是HIV-1复制的调节因子,Bai等[4]将抗-tat-rev核酶异二聚体和包膜蛋白基因env核酶/Rev适体分别连接逆转录病毒VSV-G载体,然后转导CD34+造血祖细胞,并建立了重症联合免疫缺陷小鼠模型,并籍此评估了基因转导的干细胞重建能力以及安全性,结果显示,经核酶与适体转导的CD34
8、+造血祖细胞在实验动物体内能重建人胎儿胸腺和活组织移植物,从移植物上分化的胸腺细胞抵抗HIV-1感染的能力显著提高。以慢病毒载体转移核酶或适体并导入造血祖细胞,为建立抗病毒多基因重组体用于AIDS的治疗奠定了基础。2•1•2 适体与HCV的治疗:HCV非结构性蛋白NS3具有蛋白酶和解螺旋酶活性,对HCV病毒增殖至关重要。1997年,Kumar等[5
