hbv感染不同阶段mirna表示、hbv基因式、p基因点突变之研究

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1、HBV感染不同阶段miRNA表示、HBV基因式、P基因点突变之研究第一部分xMAP液态芯片技术检测HBV感染者外周血单个核细胞miRNA的方法建立及其应用研究xMAP液态芯片技术是整合了荧光编码微球技术、激光分析技术、流式细胞技术、高速数字信号处理技术、计算机运算法则等多项最新科技组合的成果[30]。液态芯片体系是由多种微球为主要基质构成，在微球的制造过程中，掺人2种不同颜色的荧光染料，按不同比例混合，将直径为5.6um的聚苯乙烯乳胶微球(microspheres)染成100种颜色，即得到100种不同光谱地址标记的

2、编码微球。每一种微球表面都带有活性羧基化基团，氨基标记的寡核甘酸探针、抗原或配体等，可通过化学反应共价结合到微球表面，每种编码的微球可共价结合并携带一种可以捕获相应目标分子的生物探针，如抗原、抗体、核苷酸片段、酶等，将这些小球体悬浮于一个液相体系中，构成了液态芯片系统[31]。在RNA-DNA嵌合探针中，RNA碱基序列部分与靶miRNA互补，DNA碱基序列部分与微球上的捕捉序列互补，形成微球-嵌合探针-miRNA复合物，只有与miRNA完全互补的嵌合探针才能不被RNA酶消化，最后加入报告荧光染料与微球-嵌合探针-m

3、iRNA复合物结合，发出荧光而被检测。此种方法检测miRNA标本用量少，反应迅速，重复性好，无需逆转录和扩增，特异性好，并且可以多至100项检测指标灵活组合进行定性、定量分析。其原理如下图1-1所示。本实验部分旨在建立xMAP液态芯片技术高通量定量检测HBV感染者PBMCmiRNA的方法，运用这项技术检测miR-21、miR-20a、miR-31、miR-222、miR-223、miR-145和miR-126在HBV感染者肝病慢性进展中的表达情况，为寻求慢性化进展机制提供线索和依据。1材料和方法1.1研究对象169

4、例均为本院2010年10月-2011年12月住院和门诊HBV感染者，男126例，女43例，其中AHB患者40例、CHB患者53例、LC患者44例、HCC患者32例及NC组40例诊断符合2010年中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分会联合修订的慢性乙型肝炎防治指南诊断标准[32]，并满足以下条件：（1）未服用过NA抗病毒药物及免疫调节剂；（2）排除自身免疫性肝病、合并HIV和/或HCV感染等；1.2标本采集收集2010年10月-2011年12月年苏州大学附属第一医院感染科住院及门诊AHB、CHB、LC、HCC患者及

5、NC外周血标本，每例样本采集外周血5ml，立即提取单个核细胞后抽提总RNA-80℃低温保存。1.3主要试剂（1）Ficoll淋巴细胞提取液（北京赛驰）（2）TRIzol试剂(大连宝生物)（3）微球（Bio-Rad）（4）地址序列探针（上海生工）（5）1.5TMAC缓冲液（SigmaT3411）（6）StreptavidinR-phycoerythrin,conjugate(1mg/ml,INVITROGEN，S-866),Rnasin(链霉亲和素，天根生化科技，DP418)（7）RNA-DNA嵌合探针（上海吉玛生物

6、，原始浓度为10pmol/ul，实验中梯度稀释使用）（8）RnaseA（sigma，R4642）（9）SAPE染料(INVITROGEN)（10）DEPC处理ddH2O（上海生工）（11）3M，NaCl（上海生工）（12）RNA参比品（上海吉玛生物，原始浓度为100pmol/ul，实验中梯度稀释使用）2讨论从实验结果分析可知，xMAP液态芯片法检测PBMC中miRNA具有较好的准确性、特异性和重复性，以其高通量、快速、灵敏度好等显著的优点作为一种先进的大规模生物分子检测平台，具有广阔的发展及应用前景。本研究根据文献

7、报道选用表达稳定的miR-103做内参[33]，以相对定量法对miR-222、-191、-145、-21、-223、-31、-126、-20a、-372做定量研究。本研究结果发现HBV感染患者不同时期PBMC中miRNA-145、-222、-31、-21、-372在各组间的表达无统计学差异，提示此5种miRNA分子可能与HBV感染不同时期致病性及其乙肝慢性演化无关。本研究结果表明HBV感染患者PBMCmiR-20a表达显著上调，NC组表达量最低，HCC组表达最高，且随着慢性化进展其表达量逐渐增高，HCC组和其他各组

8、比较均有统计学差异，与Pogribny[8]报道肝脏组织的表达情况不同。其原因可能是HBV感染者PBMC与组织样本不同所致，结果提示：miR-20a的上调不仅参与了HBV感染患者慢性化过程且可能是乙肝性肝癌一个重要致病性miRNA分子。王亚南[34]等人的研究表明，miR-20a在肺癌组织也高表达，且可能与肺癌的原位发生有关。随着研究的深入，学者们发现不同的