体外肝代谢系统的研究与应用.doc

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1、体外肝代谢系统的研究与应用【摘要】肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。对肝药酶的研究方法中，以动物肝脏或肝细胞为基础，构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。对体外肝代谢的研究，主要是利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培养、肝组织切片及离体肝灌流系统等方法。本文综述近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统，并对各体外代谢研究方法进行比较，指出根据各系统的特性、不同的实验要求和目的，选择适当的研究方法的重要性。【关键词】细胞色素P450酶；肝微粒体；肝细胞培养；肝组织切片；离体肝灌流药物代谢一般是指药物的生物转化。药物经生物转化后可

2、引起药物的药理活性或/和毒理活性的改变。因此，研究药物的生物转化，明确其代谢过程，对新药开发、新剂型设计及制定合理的临床用药方案等方面都具有重要的指导意义。肝脏是药物生物转化的重要器官，含有参与药物代谢重要的酶系组成，主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族［1］。本文所介绍的各种体外代谢系统均含有一种或多种CYP450酶的同工酶，为研究药物体外代谢提供了研究的对象和基础动物肝体外代谢研究可以较好地排除体内因素干扰，直接观察酶对底物代谢的选择性，为整体试验提供可靠的科学依据。以肝脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞

3、、肝组织切片及离体肝灌流。1肝微粒体肝微粒体的制备多数采用差速离心法［2］，通过高速离心使微粒体与其他成分分离，操作筒单，无需其他试剂辅助。但较耗时，设备要求高，使该法的普及和深入研究受到一定的限制。针对这些情况，可采用试剂辅助分离的方法［3］，在离心前额外加入一定比例的PEG6000或CaC12，促进微粒体沉降。此法对设备要求降低，并缩短了实验周期。肝微粒体的制备过程均应在4°C下进行。正确、合理地选择缓冲液，能起到良好介质的作用，按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆，才可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。肝微粒体的主要应用测定CYP450酶活性测定原

4、理是在特定酶催化下，底物在辅助因子以及适合的温度、时间作用下反应，借助仪器测定生成的特定产物量。由于反应可控和周期短，目前大多数P450酶以肝微粒体作为反应体系进行酶活性的测定［2］。各种酶活性测定的步骤基本相同，差别主要在于酶对应的底物和检测仪器的选择。一般以鹿物及代谢途经来命名各种酶，如7乙氧基试卤灵0脱乙基酶［4］、氯唑沙宗羟化酶［5］等。根据底物特性选择检测仪器，常用的有紫外/荧光分光光度计，或联用HPLC系统。考察药物对肝药酶活性的影响某些药物在体内不同程度地诱导或抑制肝药酶活性，这将影响到同时服用的其他药物的代谢，如抑制CYP3A活性的药物

5、，若与其他经这一家族酶代谢的药物同时服用，则可能减慢其代谢，从而增强药效或毒副作用［6］。近年来，关于考察中药成分对肝药酶活性影响的报道增多，从体外分子水平来评价它们对肝代谢的影响，可为中药配伍提供依据。如代方国等［7］考察给以甘草、甘遂、甘遂甘草配伍药液的大鼠的肝微粒体中CYP2E1的活性，发现甘草组和配伍组对CYP2E1活性的诱导作用显著高于甘遂组；甘遂可能通过诱导肝脏CYP2E1的表达与活性上升；甘遂甘草配伍使用时，甘草对CYP2E1活性的诱导能力更强，故两者配伍时，可促进甘遂所含前致癌物质和前毒物转化成为致癌物和毒物的过程，并导致对机体毒性作用

6、的增强。进行药物体外代谢途径研究将药物加入肝微粒体中进行孵育后，利用质谱检测离子碎片来鉴定代谢物的结构，包括药物不同位点上的羟化物或去烷基产物，从而确定代谢途径。有报道指出［8］，新型抗焦虑药AF5加入人肝微粒体中进行孵育，经GCMS分析，鉴定出两种主要代谢产物：4羟基AF5及4羰基AF5。AF5在肝微粒体中代谢的主要产物为I，I在人肝微粒体中，可进一步转化为II，后者不再被代谢。考察手性药物的代谢立体选择性周权等［9］把手性药物与大鼠肝微粒体相结合，对其立体选择性代谢作了详细的考察。作者把R/S普罗帕酮加入经地塞米松或0萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵育

7、，经提取及手性拆分后，进入HPLC系统分析。结果显示，与对照组相比，在经诱导的肝微粒体中，PPF的I相代谢呈显著的立体选择性。总之，改进后的体外肝微粒体法耗时少，重现性好，易大量操作。适用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究，在实际工作中应用较广。但同其他体外肝代谢方法相比，需要的原材料较多，且与体内情况的一致性方面存在不足，因而其结果是否有利预测体内情况仍需进一步研究。2基因重组人肝微粒体CYP450酶系利用基因工程及细胞工程，将调控CYP450酶系表迗的基因整合到大肠杆菌或昆虫细胞，再经培养可表迗高水平的CYP450酶系，纯化后还可获得较单一的CYP

8、450同工酶。在明确某些药物经特定酶代谢后，即以此酶进行单一代谢，更准确地观察代谢结果，避免受