关于体外肝代谢系统的研究与应用探讨

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1、关于体外肝代谢系统的研究与应用探讨　　毕业论文摘要：肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。对肝药酶的研究方法中，以动物肝脏或肝细胞为基础，构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。对体外肝代谢的研究，主要是利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培养、肝组织切片及离体肝灌流系统等方法。本文综述近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统，并对各体外代谢研究方法进行比较，指出根据各系统的特性、不同的实验要求和目的，选择适当的研究方法的重要性。　　关键词：细胞色素P450酶；肝微粒体；肝细胞培养；肝组织切片；离体肝灌流　　1肝微粒体肝微粒体的制备　　多数采用差速离心法［2］，通过高

2、速离心使微粒体与其他成分分离，操作简单，无需其他试剂辅助。但较耗时，设备要求高，使该法的普及和深入研究受到一定的限制。针对这些情况，可采用试剂辅助分离的方法［3］，在离心前额外加入一定比例的PEG6000或CaCl2，促进微粒体沉降。此法对设备要求降低，并缩短了实验周期。肝微粒体的制备过程均应在4℃下进行。正确、合理地选择缓冲液，能起到良好介质的作用，按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆，才可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。测定CYP450酶活性　　考察药物对肝药酶活性的影响　　进行药物体外代谢途径研究　　将药物加入肝微粒体中进行孵育后，利用质谱检测离子碎片来鉴定代谢物的结构，包括药物

3、不同位点上的羟化物或去烷基产物，从而确定代谢途径。有报道指出［8］，新型抗焦虑药AF5加入人肝微粒体中进行孵育，经GCMS分析，鉴定出两种主要代谢产物：4羟基AF5（Ⅰ）及4羰基AF5（Ⅱ）。AF5在肝微粒体中代谢的主要产物为Ⅰ，Ⅰ在人肝微粒体中，可进一步转化为Ⅱ，后者不再被代谢。　　周权等［9］把手性药物与大鼠肝微粒体相结合，对其立体选择性代谢作了详细的考察。作者把R/S普罗帕酮（propafenone，PPF）加入经地塞米松或β萘黄酮诱导的大鼠肝微粒体中孵育，经提取及手性拆分后，进入HPLC系统分析。结果显示，与对照组相比，在经诱导的肝微粒体中，PPF的Ⅰ相代

4、谢呈显著的立体选择性。　　总之，改进后的体外肝微粒体法耗时少，重现性好，易大量操作。适用于酶活性及体外代谢清除等方面的研究，在实际工作中应用较广。但同其他体外肝代谢方法相比，需要的原材料较多，且与体内情况的一致性方面存在不足，因而其结果是否有利预测体内情况仍需进一步研究。2基因重组人肝微粒体CYP450酶系　　　基因重组CYP450酶系与前述的肝微粒体在研究药物代谢方面具有一定的相关性。但前者在药酶诱导特异性和选择性研究上优于其他的体外方法，并可在分子水平上，为药物与酶在结合位点的相互作用研究提供更多的信息。尽管该方法先进性较为突出，但由于受到设备条件和技术的限制，通过基因工程获得的酶

5、量与种类仍较有限，纯化程度有待进一步提高，故其作为研究代谢的体外系统的地位仍有待进一步提高。3肝细胞培养体外培养技术与细胞活性的维持　　体外培养包括肝细胞株的培养和原代肝细胞的分离与培养。根据细胞来源于不同，经重复筛选可制备出不同型号的肝细胞株，满足各种实验需要。肝细胞株容易贴壁存活，在相对稳定的培养条件下，传20～30代不会出现明显衰老现象。原代细胞需经过从器官中分离的过程，存在分离难度大、体外培养要求条件高、存活时间短、增殖及传代困难等问题。多数研究者采用改良的Seglen两步胶原酶灌注法。但此法操作繁琐，设备及实验技术要求高，影响因素较多［14］，包括灌注液的种类和速度、肝脏灌洗

6、是否充分、分离消化的酶、培养液的组成和肝细胞悬液的离心清洗等。鉴于上述原因，刘友平［15］等采用肝组织块贴壁法原代培养，即只把组织块剪碎，不用胶原酶消化，直接按肝细胞的培养方法进行贴壁培养，在传代时加胰酶消化，只取上层细胞悬液继续培养。该法简单快捷，无需灌注、离心，所得肝细胞活力高。　　为了解决肝细胞活性体外维持时间短的问题，Hengstler［16］等研究优化肝细胞冷冻技术。同新鲜肝细胞相比，经过该技术冷冻储藏的肝细胞活性为新鲜肝细胞的80%以上，而其Ⅰ相、Ⅱ相代谢酶的活性>60%，可用于反应时间不超过8h的代谢研究，亦可用于药酶的诱导研究，但该技术仍需进一步优化。肝细胞培养的主要应

7、用进行药物体外代谢途径与体内相关性研究　　进行药物体外代谢清除研究　　Shibata［19］等人运用冷藏保存的人肝细胞混悬于100%的人血浆中，将预测的肝利用度及清除率与14种临床常用的药物的生物利用度和血浆清除率进行比较时，发现不同的细胞来源，内在清除率存在极大的个体差异性。同时在基础的生物定标系数（×109个/kg）下，用外推法将体外实验结果应用于体内实验的预测，往往会出现明显的偏低现象，因此计算的定标系数应比基础生物大3～5倍。为获得更可