探讨血清结核杆菌特异性抗原对诊断结核病中的作用

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1、探讨血清结核杆菌特异性抗原对诊断结核病中的作用黑龙江省传染病防治院150518【摘要】目的：研究分析从人血清提取ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被进行抗原检测，并讨论结核病诊断新方法。方法：利用木室构建并纯化的结核分枝杆菌特异性抗原蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68,建立结核分枝杆菌特异性抗体检测的间接ELISA检测方法，并与PPD-EUSA同时检测220例结核病人血清、30例非结核呼吸疾病病人血清和50例健康人群血清，分别对三种方法的敏感性与特异性进行统计学分析。结果：ESAT6-EUS

2、A的敏感性为25%,特异性为95%；CFP10-ESAT6-ELISA的敏感性为45%,特异性为93%；ESAT6-PPE68-ELISA的敏感性为48%,特异性为85%。结论:三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的敏感性均低于PPD-ELISA,但三种结核分枝杆菌特异性抗体检测方法的特异性均高于PPD-ELISA,其中CFP10-ESAT6-ELISA检测的效果最佳，PPE68可作为结核特异性诊断的候选抗原。【关键词】结核分枝杆菌；ESAT6；CFP10；PPE68；ELISA结核病作为一种慢性传染性疾病，近年来发病率有上升趋势，临床上认为结核分

3、枝杆蘭引发呼吸道慢性传染是结核病发病的根源，由于其较高的感染率与耐药性，因此结核病的快速诊断对于结核防治有着重要的作用，但至今尚没有一种准确、快速、可靠的检测结核分枝杆菌感染的方法。结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)是从结核分枝杆菌培养滤液中获得的复杂蛋白物质，含有多种抗原成分，其最大的弱点是PPD所乜含的抗原为致病性分枝杆菌、非致病性分枝杆菌和卡介苗(bacilluscalmetteguerin,BCG)所共有［1］，故阳性结果也不能区分是致病性分枝杆菌还是非致病性分枝杆菌感，染抑或是接种BCG免疫的结果，大大减低了检测的特异性。因此木实验以PP

4、D为参考，在建立PPD-EUSA的基础上，以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为抗原，并对三种特异性抗体ELISA检测方法在对结核病的诊断效果进行了比较和评估。1材料与方法1.1抗原与主要试剂纯化重组蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68由本室前期制备，结核分枝杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）由贵阳市疾病预防控制中心提供。主要试剂：牛血清白蛋白（BSA）由上海生工公司提供；脱脂乳（MILK）为雀巢公司产品；HRP标记的羊抗人IgG及DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司；96孔酶标板为德国Gr

5、einer公司产品；ELISA相关溶液由实验室自己配制。1.2结核病参考血清和临床待检血清结核病参考血清和临床待检血清由贵阳疾病预防控制中心提供。临床待检血清中220例为痰涂片染色镜检阳性、临床及X线诊断为肺结核的结核病人血清，其中男148例，女72例，年龄14〜78岁。30例非结核呼吸疾病病人（肺炎、急慢性支气管炎、肺癌）血清由我院呼吸科提供。1.3方法1.3.1PPD-ELISA最佳反应条件的确立抗原PPD按1:400包被，即42μg/ml,放置4°C过夜，取出洗涤5次，每次5min后，每孔加入200μl1.0%BSA封闭液，37

6、°C封闭lh。血清样本用PBST按1:40稀释，100μl/孔，37°C反应lh后，洗涤5次。加入1:2000稀释的HRP标记的羊抗人lgG100μl/孔，37°C反应30min,洗涤5次，最后拍干，每孔加入DAB底物液100μl,室温避光反应10min,最后加入508^11;120301/1.^12504终止反应，用酶标仪在490nm波长下测定吸光度A值。PPD-ELISA阴阳界限的确定：PPD-ELISA检测80份健康人群血清，计算样品/阴性（S/N）平均值为1.55,SD为0.32,求得临界S/N=X+2SD=2.19,临

7、界吸光度A值为N×2.19,当N<0.05吋以0.05计算。1.3.2结核分枝杆菌特异性抗体ELISA检测方法的建立分别以结核分枝杆菌特异性蛋白抗原ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68作为包被用抗原，参照确立的PPD-ELISA方法，方阵滴定确定特异抗原ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68的抗原包被液均按照1:200稀释，浓度分别为8μg/ml、9μg/ml和10μg/ml,血清稀释度为1:40。建立三种间接ELISA检测方法，检测病人血清中的结核分枝杆菌特异性抗体，

8、分别命名为ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68。参照PPD-ELISA临界值的确定方法，计算各ELISA的临界值。