将聚合酶链反应技术应用在感染性疾病的诊断中

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1、将聚合酶链反应技术应用在感染性疾病的诊断中-->聚合酶链反应技术(PCR)是1985年由美国Getus公司的研究人员创建的DNA体外扩增技术，是80年代中期出现的分子生物学的新技术。自从问世以来，已在遗传病诊断、微生物检验、癌变监测、法医鉴定等许多领域得到广泛应用。开创了检验诊断技术的第三次飞跃，实现了从分子和基因水平对病原学的阐述。对于基因分析技术的发展产生了巨大的推动作用。感染性疾病的诊断，过去多采用临床诊断、形态学诊断、生化学诊断及血清学诊断的方法，这些方法有时存在灵敏度和特异性低及速度慢等不足之处，在技术操作方面也存在一定的局限性，有的病原体侵入人体后需

2、潜伏一定时间后才出现抗体，用血清学和生化学方法很难及时诊断出来;有的病毒(如艾滋病病毒)的血清学诊断只有确定是否接触过这种病毒，但不能肯定是否存在现行感染，而分离、培养病毒是十分繁锁的。PCR技术和上述方法相比，具有高度的特异性、灵敏性、操作简便、快速等优点，国内外已在几十种感染性疾病中开展应用。1、乙型肝炎病毒乙型肝炎是世界性传染病，在第三世界中流行尤其严重，中国亦是乙肝的高发国家。乙型肝炎病毒的DNA是已知动物病毒中基因组最小的分子，由部分双链环形DNA组成。其全基因组序列已经测出，不同亚型或不同毒株间核昔酸总数稍有差异，各基因的定位也已十分明确。美国人La

3、neko等应用0.01Pg的克隆乙肝病毒DNA为模板，设计了C基因特异的一对引物，扩增产物应用琼脂糖凝胶电泳分离后，嗅化乙锭(EB)染色法或PCR一Southern印迹杂交法或斑点杂交法进行鉴定，使乙肝病毒检测的灵敏度可达到样品中10-5pgDNA，是目前所有用于乙肝诊断方法中敏感度最高的一种，它在临床诊断中的普及应用，可使人们对病毒在宿主体内的感染状态有新的认识。2、人类乳头瘤病毒人类乳头瘤病毒(HPV)基因组为双链闭环DNA，是一种有明显异质性的病毒，每一型病毒都与特定的皮肤粘膜病变相联系。近年来发现人类生殖道HPV感染明显升高，且有证据表明这与生殖道癌瘤的

4、发生有一定关联，因此寻找一种简便、敏感而特异的诊断HPV感染的方法十分重要。美国人shibata等应用PCR方法扩增靶序列，少至0.01pg的HPV一16一PBR322或HPV一18一PBR322DNA能被扩增而显出一条十分清晰的带，因此在大量宿主基因DNA存在情况下，仍能特异地发现病毒的感染。3、艾滋病毒艾滋病是在本世纪出现的对人类危害最大的一种传染性疾病，是因人类免疫系统缺陷病毒(HIV)感染所至。HIV属于逆转录的RNA病毒，在细胞内繁殖水平较低，难以培养，也不易用血清学方法检出。Kellogg选取病毒基因中的高度保守区，设计了两对引物和一对探针，以HLA

5、一.DQa基因的扩增作为HIV基因扩增的内对照，扩增产物结合寡核昔酸探针杂交，HIV抗体阳性者的HIV检测率达96%。4、螺旋体莱姆氏病是由博氏疏螺旋体感染所引起的一种疾病。在北美、欧洲等国较常见，有人称之为仅次于艾滋病的第二位传染性疾病，其临床表现多种多样，很不典型。此类螺旋体感染后引起的免疫反应很弱，血清学方法存在不敏感及交叉反应强等缺点，菌体分离很困难，培养条件复杂，阳性率很低，临床上诊断不易。美国人Malloy等针对博氏疏螺旋体外膜蛋白基因(PsPA)设计了一对引物，扩增产生309bp长的片段，应用扩增产物进行电泳检查及斑点杂交，对于所检测的十株博氏螺旋

6、体均呈阳性。而其它细菌和疏螺旋体均呈阴性，同时在样品制备上简化了DNA步骤，采用样品处理一步法进行PCR，得到了很好的效果，为临床开展检测工作提供了方便。我国学者采用PCR方法进行博氏疏螺旋体鞭毛蛋白基因的检测，也取得了满意结果。5、支原体目前认为，肺炎支原体肯定为人类原发性非曲型肺炎的病原体。美国人Bemer从肺炎支原体标准株DNA中分离出长度0.5一1.0kb的片段，插入质粒载体建立基因库，并从中选出144bp长的DNA片段作为目的基因，合成引物及寡核普酸探针，不同的肺炎支原体株经PCR后进行斑点杂交或Southernblot分析，均呈阳性而其它支原体则均为

7、阴性，应用此方法对实验性感染肺炎支原体的动物标本进行检测，并同时比较PCR方法、分离培养和同位素探针杂交法，结果PCR方法更敏感和稳定。6、结核杆菌结核在我国仍然是对人民生活产生严重影响的细菌，且治疗时间长，疗效慢，故建立快速敏感的结核菌检查法，无论对结核的诊断，还是疗效观察都有重要意义。美国人Pierre采用再次扩增法对结核杆菌65kDa蛋白抗原基因进行扩增，提高了检测的敏感性，用于检测临床标本和痰液、支气管灌洗液、胸腔积液等，可以有效地防止这些标本中的物质对Taq聚合酶的抑制作用，从而使临床标本中结核杆菌的检出率大为提高。Ralphs建立的扩增结核杆菌l.5

8、kb特异性片段的PCR方