应用聚合酶链反应体外基因扩增技术诊断肺结核的研究

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1、应用聚合酶链反应体外基因扩增技术诊断肺结核的研究郜凌云(黑龙江省哈尔滨市胸科医院150056)【中图分类号】R521【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)19-0037-02痰液中查到结核菌是诊断肺结核病的最重要依据。讼期以来，在结核病细菌学诊断的传统方法中，临床标木直接涂片镜检抗酸菌，尽管操作技术简便易行。但检出率低，特异性差；而分枝杆菌培养虽能提高阳性率，可是需要很长时间，从而影响结核病的及时诊断.因而我们根据1985年Mulis等创建的聚合酶链反应体外DNA扩增技术，应用于肺结核诊断的研究，以其建立一种快速、敏感、特异的

2、诊断方法，为在结核病临床诊断中逐步推广使用提供参考。现将实验研究结果报告如下：1材料和方法1.1标木来源69例结核性痰标木、22例结核性胸水、17例非结核性痰标卒(肺炎9例，支气管扩张3例，肺癌5例)、8例癌性胸水，均来源于木所和市胸科医院病人，根据临床表现，胸部x线检查以及细菌学或病理组织学检查确诊的。1.2涂片和培养检查临床标木除PCR检测外，同时作涂片和培养检查以资对比。涂片和培养按常规方法进行(1)。涂片在油镜下观察300个视野见到3条以上抗酸菌或在培养基斜面上生讼20个以上菌落即判为阳性。1.3临床标木DNA提取取痰液1〜2ml加等量l

3、×Tris.HCL-EDTA溶液后，再加消化液50μl。置80°C水浴30分钟，其间振摇数次,2500〜3000rpm离心10分钟。取上清0.5ml加裂解液50μl,置95°C水浴15〜20分钟后，分别加等量平衡酚、酚/氯仿、氯仿各抽提一次。再取上清加1/10体积NaAC溶液和2倍体积无水乙醇混合后,置-20°C冰箱内2小时以上，在4°C10000〜12000rpm离心30分钟。弃去上清，风干沉淀，溶于适量TE中备用。胸水标木勿需消化处理，其余步骤与痰标本DNA提取方法相同。1.4引物合成采用Pao等(2)报道的寡核苷酸序

4、列引物，1.CTAGGTCGGGTGAGGCCAGG,2.CATTGCGAAGTGATTCCTCCGGAT,由解放军309医院结核病研究室合成和提供。1.5PcR扩增取临床标本DNA溶液5微升，加入500μl塑料离心管中。顺序加入ddH2O16.5微升，10×buffer2.5微升、4×dNTP2.0微升，Primer2.0微升,DNA2.0微升混匀，95°C变性10分钟，稍冷却后加TagDNA多聚酶0.2〜0.5微升，加火菌液体石蜡40微升，短时离心使之分层良好，置扩增仪94°C变性1分钟，65°C退火1分钟，72

5、°C延伸2分钟，重复循环35次，最后72°C延伸7分钟。1.6扩增产物检测取扩增后样品5〜10微开，在2%琼脂糖凝胶中电泳。电压60〜80V,30分钟后在紫外线检测仪254nm下观察电泳带，可见165bp扩增带即可判定为PCR检测结核杆菌DNA阳性。1.7每次PCR扩增均没右人型结核杆菌(H37PV)DNA阳性对照及无模板DNA阴性试剂对照。2结果2.1PCR检测结核菌DNA敏感性和特异性的观察本试验将纯化的人型结核菌DNA,由每微升lOOng开始10倍系列稀释到10fg,分别进行PCR检测。结果显示lOOng至lOOfgDNA均可见165bP阳

6、性扩增带，在7种受试抗酸分枝杆菌中，除人型结核菌、中型结核菌和BCGDNA可见165bp特异性扩增带外，其余4种分枝杆菌(鸟、胞内、堪萨斯，瘰疬分枝杆菌)DNA均末见该扩增片段.本实验表明，应用PCR方法检测结核杆菌复合体具奋高度的敏感性和特异性，与国内报道一致。2.2临床标本检测结果本实验116例患者临床标本分别作涂片。培养和PCR检测，17例非结核性痰标本及8例癌性胸水的涂片镜检、培养和PCR检测结果均为阴性、69例结核性痰标本及22例结核性胸水的涂片阳性率分别为:24.6%,4.5%,培养阳性率分别为37.7%，0（末见阳性），而PCR阳性

7、率分别为73.9%、68.2°%，明显高于前两种方法，经统计学处理均有显著差异（P均<0.01）,与文献报道相仿。（见附表）。附表91例结核性临床标本三种方法检验结果比较标本例数阳性例数（％）涂片镜检培养PCR痰6917(24.6%)26(37.7)51(73.9)胸水221(4.5%)0(0)15(68.2)3讨论本文实验研究结果表明，应用PCR技术可检测出100ng至lOOfg结核菌DNA,因而具有极高的敏感性，结果也表明，所选择的扩啬靶序列和引物，只有人型结核菌，牛型结核菌和BCGDNA可见165bp特异性扩增片段，其余受试非结核性分

8、枝奸菌均未见任保扩增带，从而显示对结核分枝杆菌复合体具奋高度本组116例临床标本中，25例非结核性临床标本采用涂片、培养和PCR等三种方