临床诊断中聚合酶链反应(pcr)技术的应用

《临床诊断中聚合酶链反应(pcr)技术的应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、WS/T230-2002临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用Guidelinesforuseofpolymerasechainreaction(PCR)techniqueinclinicaldiagnosis1范围   本标准规定了临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用准则。   本标准适用于各级，各类的医疗、卫生、保健机构应用PCR技术进行临床诊断。2定义   本标准采用下列定义。2.1引物primer   与待扩增靶DNA片段两端互补的寡核昔酸，其本质是单链DNA(ssDNA)，在DNA聚合酶的作用下能进行延伸，从而合成新的互补链

2、。2.2模板template   待扩增的靶DNA或RNA链，包括人类基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、eDNA和mRNA、扩增后的DNA产物等几乎所有形式的DNA或RNA。2.3变性denaturation   DNA或RNA由双链转变为单链状态，加热、提高pH或加入甲酰胺、脲等试剂都可使双链DNA或RNA发生变性。2.4 退火annealing   引物与互补的核苷酸序列在合适的温度下通过氢键形式相互结合的过程。2.5 延伸 extension   在合适的条件下，由DNA聚合酶（如：Taq酶）催化引导引物DNA链延伸的合成过程。2.

3、6 污染 contamination   由来源子非待测样品的核酸所引起的一个样品、一系列样品或试剂的非特异性扩增或扩增后在产物分析过程中造成的样品之间的污染，污染通常引起假阳性结果。2.7 遗留污染 carry-overcontamination   同一类靶序列上一次PCR扩增产物对以后扩增反应的后续污染。2.8 内对照 internalcontrol   在同一反应混合物体系中与待测靶核酸同时进行扩增反应的已知对照物。2.9TaqDNA聚合酶 TaqDNApolymerase   一种耐热的DNA聚合酶，最初是从美国黄石国家公园温泉中存在

4、的水生栖热菌(Thermu$aquati-cus)中分离获得，Taq酶最适活性温度在70℃～80℃，能耐受PCR变性过程中的高温，是目前PCR扩增反应中经常使用的DNA聚合酶。2.10抑制物／干扰物inhibition/interference   临床样品中能导致假阳性或假阴性扩增的内源性物质（如血液中的某些成分，痰液中的酸性多糖、尿液、体液等）和外源性物质（如滑石粉、抗凝剂等）。2.11 dNTPdeoxynueleotidetriphosphate   三磷酸脱氧核苷，包括dATP、dUTP、dCTP、dGTP、dTTP等。在PCR扩增反

5、应中，作为反应底物聚合形成新的DNA链。2.12热循环仪thermocycler   在PCR或其他需要在反应过程中转换温度的体系中用来保证温度准确快速转换的设备。3用途   对目前已有稳定、可靠的微生物学和免疫学方法检测的疾病或病原体，不推荐应用PCR进行检测。例如，大多数的细菌感染通过细菌培养3～4天即可报告并明确药敏结果；对甲型肝炎病毒等的感染。通过对其抗原或／和抗体的检测也可明确诊断。对于目前尚无其他实验室诊断技术或现有的诊断技术不成熟、敏感性太低、不能及时准确地反映感染情况的疾病，可推荐应用PCR技术进行检测。如丙型肝炎病毒的感染，检

6、测其抗体不能做到早期诊断、也不能表明血清中有无病毒的存在，又如结核杆菌的感染，培养需2～3个月，耗时太长，影响诊断，对此类病原体，PCR检测有其独到的优点。   PCR临床实验根据其应用的不同可分为三个互相交叉的类型t“过筛实验”，“诊断实验”、“验证实验”。3.1过筛实验   过筛实验适用于数目较大的群体，可能大部分元症状（疾病的流行性可能很低）。一个阳性结果并不能确定病原微生物的流行或反映某种疾病状态，它只能提示有必要作进一步的检测。较高的诊断敏感性和阴性可信度是过筛实验最重要的特性。3.2诊断实验   诊断实验用于当地某种疾病流行率很高、

7、疑诊患有某种疾病（或特异性感染）的群体，特异性靶基因（或病原体）的有无对诊断和治疗有重要意义。因此，要求在保证实验特异性的情况下-敏感性尽可能地高。3.3验证实验   对于过筛实验或诊断实验为阳性的情况，验证实验可作为其补充实验，用于确诊。特异性和阳性可信度是验证实验最重要的特性。4方法4.1 引物序列的选择   引物的设计是在模板序列中挑选出两段寡核苷酸片段，使其能有效地扩增模板。模板序列的选择随着检测的不同而不同，但也有一些共同之处，如：1）模板序列应是特异的-即不存在和其他序列同源的序列（尤其是在引物部分），模板序列的选择应避免核苷酸重复

8、片段区I2）模板序列在某些情况下需要的是种属内部的保守区、非保守区（尤其是引物部分）或属内特异区。   选择合适的引物是保证PCR扩增特异性和敏感性的