聚合酶链反应在幽门螺杆菌感染中的新进展

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1、聚合酶链反应在幽门螺杆菌感染中的新进展　　1　PCR原理　　PCR是近年发展起来的一种体外扩增特DNA片段的技术，有关它的原理许多文献已有详细介绍，这里只作简述PCR的每次扩增循环包括三步，第1步为变性，在高温下把双链靶DNA拆开；第2步，在较低的温度下使引物与靶DNA互补；第3步在中间温度下，在DNA多聚酶作用下，引物按模板DNA延长，典型的PCR包括30～50循环，如此重复循环，使被扩增的靶核苷酸以几何级数扩增，在PCR操作中，有几点必须考虑。①选择引物长度以15～30个碱基为宜，太短特异性不

2、佳，太长不增加特异性而合成费用增加。②引物中应尽量避免单高重复的核苷酸结构，同时还要考虑引物本身的物理特性，避免经物自身退火。③反应的退火温度慎重选择，温度高可提高特异性，但敏感性隆低，温度低则反之。　　2　引物选择　　2.1　尿素酶基因核苷酸　　Hp分泌大量的尿素酶，该酶是导致哺乳动物对Hp产生免疫应答的重要抗原，可能是Hp的重要致病因子之一，因此许多学者采用尿素酶核苷酸序列中的部分片段作为引物。Clayton等报告了Hp尿素酶基因（ureA和tureB）的核苷酸序列，筛选到ureA和tureB

3、两个亚单位，并测得了它们的核苷酸序列。目前有代表性的采用以尿素酶部分核苷酸顺序为引物对的有：Clayton采用一对18个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的DNA产物为411个碱基对。其他学者都是以Clayton报告的Hp尿素酶基因的部分核苷酸序列为依据而设计PCR的引物。Courcoux等选择尿一纱酶C基因中的一段294bp作PCR反应。　　2.2　16SrRNA核苷酸顺序　　所有细菌的rRNAs根据其大小分为三种：含120个核苷酸的5srRNA；含1600个核苷酸的16SrRNA及含300

4、0个核苷酸的23SrRNA。分析细菌16srRNA现已作为细菌分类的一个指标。大量研究证明，Hp的部分16srRNA与弯曲菌属细菌显著不同，目前采用以16SrRNA部分核苷酸顺序为引物的主要有Ho等，采用一对20个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导扩增后的DNA产物为109个碱基对。有些学者用PCR拉增Hp及与其相类似微生物的16srRNA，以此来识别H.pylori，H.mustelac和H.canis。　　2.3　编码Hp特6kD蛋白质的核苷酸　　O'Toole等报告Hp提取物中大量的26000

5、蛋白质，提出此蛋白质是Hp特异蛋白质，并分析编码该蛋白质核苷酸序列。Hammar等以此为依据，设计一对23个碱基的寡核苷酸链为引物，特异引导拉增后的DNA产物为298个碱基对。　　2.4　其它　　Valentine等从基因库中选出1.9kd的DNA片段作为探针，与19株Hp反应都为阳性，与32种306株其它细菌均无反应，其特异性为98.7％，假阳性是由于载体污染。由此从1.9kdDNA中的已知288个碱基片段中选出一对20个寡核苷酸链为引物，其特异引导扩增后DNA产物为203个碱基对。　　纵观不同

6、学者选出的引物，这些引物都能特异地以Hp的DNA为模板，扩增Hp的部分核苷酸，而不引导扩增其它细菌的核苷酸。　　3　应用　　3.1　临床诊断　　自从成功分离出Hp以来，由于Hp感染在临床上的重要性，迫切需要一个快速敏感检测检测标本的方法，学者们在不断探索各种诊断Hp感染的方法。传统的培养方法由于细菌生长要求高，死亡或菌量过少，则常规方法难以检出，其它方法如同位素标记的二氧化碳呼气试验，费用贵，快速尿素酶试验由于制剂标准不统一，消化道其它一些细菌也产生尿素酶，使该方法的特异性受到影响，检测抗Hp抗体

7、方法简易，但很难区分是否为近期感染，随着分子生物学技术不断发展，最近有些实验室采用PCR技术诊断Hp感染，取得满意结果，Ho等采用16srRNA的部分核苷酸序列为引物，其引物不引导拉增与Hp的16SrRNA十分相近的H.cinaedi，H.mustelac，H.hepaticus和产生琥珀酸沃林氏菌。检测10份已知Hp阳性的病理切片都为阳性，另外4份胃粘膜活检标本符合已知结果并且能检测到不能培养的Hp圆球体的DNA，进一步测试从猪，狒狒和猴胃中分离的细菌，并用内部探针与扩增的DNA产物杂交，提示从

8、这些动物中分离的细菌都为Hp。Engstrand等选用的16srRNA引物顺序与Ho者不同，采用了反向转录PCR技术，先利用反转录酶合成RNA，然后再扩增cDNA。其敏感性比常规PCR提高25～50倍，可检测到2个细菌，检测15份标本，14份标本与呼气试验和培养相同，该方法的特异性为100％，Nguy等用该方示检测口腔齿斑标本，18例Hp阳性病人中有7例阳性，7例未感染Hp病人中，口齿斑未测到Hp，该结果提示口腔很可能是Hp除胃以外体内另一居留地，这也可能是有些病人抗Hp治疗后复发