人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析小论文

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1、实验名称：人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析姓名：指导教师：专业：生物科学实验班级：实验时间：实验地点：遗传实验室成绩：人类外周血淋巴细胞的分离培养与核型分析一.实验目的1.掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。2.掌握离心机使用、低渗处理、染色、采血技术。3.学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。一.实验原理人体外周血液中小淋巴细胞，通常都在G1期或GO期，一般情况下是不分裂的。当在离体培养条件下，加入植物凝血素(PHA),小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和同定，就可获得大量的有丝分裂

2、细胞。人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养，白细胞中含有小淋巴细胞。所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G1期或GO期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞丁

3、•中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显形而利于辨认。体外培养的原理是将离体的细胞放入培养基中进行生长繁殖，保持细胞的生命活力，便以对细胞进行各方面的研究。体外培养技术己经广泛应用在杂交瘤技术制备单克隆抗体，动物细胞的大规模培养，微生物制药技术，基因转染与细胞融合以及细胞转化工程技术等方面。低渗处理的目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞，染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，经后血影浮于上清屮被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善

4、了淋巴细胞的固定质量及标本质量。一.实验材料、试剂和仪器1.实验材料：人外周血淋巴细胞2.实验用具：2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。3.试剂药品：(1)RPMT“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或C0/气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO,1.0—1.2g,以干冰或C02气体校正pH至7.0—7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤火菌，分装待

5、用。(2)肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U),用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml500U。高压消毒8磅15rdn。(3)秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg,用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4'C保存。使用吋用lml注射器吸取该溶液0。05—0.lml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug/ml。(4)植物凝血素(PHA):是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法冇两种。一种比较简单，直接用

6、四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g,用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4°C)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转/min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。酒精乙醚提取法：四季豆50g，先用生理盐水洗净。将豆浸入60ml盐水

7、屮，保存于4°C冰箱内，24h后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加140ml盐水，置4°C冰箱中24h，取出后以6000转/min离心20min,吸取上清液，调pH至5.6（用0.lmol/LHCl调）之后，每100ml上清液加40ml无水酒精,加以搅拌，以3000转/min离心15min,取上清液，弃去沉淀。在每100ml上清液中加170mll0%乙醚无水酒精（10ml乙醚十90ml无水酒精）以3000转/min离心15min，取沉淀放入培养皿屮，在含有硅胶的抽气干燥器屮抽气2—4d，沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末，以0.85%NaCl液配成1%的

8、溶液，此PIIA溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中，冰冻保存。使用吋每5ml培养物