大鼠外周血淋巴细胞分离方法

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1、大鼠外周血淋巴细胞分离方法1.实验前准备2.使用方法说明及图例2.1血液样本分离液使用说明及图例3.HES-TBD550使用说明4.注意事项5.性能指标6.细胞计数方法与要点7.初学者易犯的错误8.生产企业9.参考文献1.实验前准备A．试剂大鼠外周血淋巴细胞分离液、全血及组织稀释液、细胞洗涤液、羟乙基淀粉550、胎牛血清B．器材玻璃离心管、玻璃滴管水平转子离心机、无菌工作台2.使用方法说明及图例2.1血液样本分离液使用说明及图例A.小量分离-使用1-2ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：a.取新鲜抗凝血1-2ml，与全血及组

2、织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1混匀；b.小心加于与混合液等体积的细胞分离液（货号：LTS1083）之液面上；c.以400g（约1500转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含4-5ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。B.中量分离-

3、使用5-10ml新鲜抗凝血（分离图例见图例1）：a.取新鲜抗凝血5-10ml，与全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）1:1混匀；b.将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）；c.以500g（约1800转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含10ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）

4、离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。C.大量分离I-使用20ml新鲜抗凝血（分离图例见图例2）：a.取新鲜抗凝血20ml以200g（约1100转/分）离心20分钟弃去血浆；b.向弃去血浆的血细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）12ml小心混匀；c.将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）；d.以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。第三层；

5、为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含20ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需细胞。D.大量分离II-使用50ml新鲜抗凝血（分离图例见图例3）：a.取新鲜抗凝血50ml与羟乙基淀粉550（HES-TBD550）液1:1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20-30分钟。吸取混浊的上清液备用，弃去底部红细胞。b.将步骤1中留取的上清液以200g（约1100转/分）离心20

6、分钟弃去上清保留沉淀细胞；c.向沉淀的细胞中加入全血及组织稀释液（Cat#：2010C1119）20ml小心混匀；d.将混合液小心叠加于细胞分离液之液面上（混合液：分离液=2：1）；e.以600g（约2000转/分）离心15分钟(半径15cm水平转子)；此时离心管中由上至下细胞分为四层。第一层；为血浆层。第二层；为环状乳白色淋巴细胞层。第三层；为透明分离液层。第四层；为红细胞层。收集第二层细胞放入含20ml细胞洗涤液（Cat#：2010X1118）的试管中，充分混匀后，以500g（约1800转/分）离心20分钟，弃去上清留沉

7、淀细胞重新悬起。重复洗涤2次即得所需淋巴细胞。注：提取率大于90%。血液（人）中各细胞含量参考值：红细胞男：4.0-5.5×1012/L(400-550万个/mm3)女：3.5-5.0×1012/L(350-500万个/mm3)新生儿：6.0-7.0×1012/L(600-700万个/mm3)成人：4.0-10.0×109/L(4000-10000个/mm3)白细胞新生儿：15.0-20.0×109/L（15000-20000个/mm3)血小板100-300×109/L（10万-30万个/mm3)名称占白细胞总数百分比嗜中

8、性粒细胞30%-70%白细胞分类计嗜酸性粒细胞0.5%-5%数嗜碱性粒细胞0%-1%淋巴细胞20%-40%单核细胞3%-8%分离图例3抗凝血50ml与HES-TBD5501：1混合后再与1份注射用生理盐水混匀20℃-30℃静置20-30分钟3.HES-TBD550使用说明HES是从支链淀粉