人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析

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西南大学《细胞生物学自主实验》课程论文论文题目：人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析学院：生命科学学院专业：生物科学年级班级：2010级5班校区编码：北区学号：222010317011128姓名：陈建坤二零一二年十二月四日 人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析10级生科5班3组陈建坤学号：222010317011128【摘要】：染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。本文着重介绍通过对人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析，初步了解到对人体外周血淋巴细胞培养方法与人类体细胞染色体核型分析的方法。该实验采用人工离体培养的方法，采集人体外周血淋巴细胞，在加有植物血球凝集素（PHA，刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂）的培养基中培养。经过（72±2）恒温培养，秋水仙素处理、低渗和固定，获得大量有丝分裂中期细胞。最后经过空气干燥法制片，对人体外周血淋巴细胞进行染色体核型分析。【关键字】：人体外周血淋巴细胞染色体核型人工离体培养一．引言:染色体是遗传物质的载体，它具有贮存和传递DNA、控制基因活动和调整基因重组的作用。人类染色体核型分析是将人的一个体细胞有丝分裂中期的染色体，在技术的基础上，按照染色体的大小和形态特征（主要根据着丝点位置），对染色体进行分组、排队和配对。这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。直到上世纪50年代，科学家对染色体本身的细致深入研究才成为可能。染色体组型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间，人类G显带核型图谱关系所不可缺少的重要手段。1952年徐道觉用低渗法使细胞膨胀，使染色体充分分散开来。1956年，Tjio等用秋水仙素使细胞分裂固定在分裂中期，增加了细胞分裂相。之后，有科学家建立了人体外周血培养法，使得染色体取材变得更加容易，大大推动了人类对染色体的研究。二．人体外周血淋巴细胞培养与染色体核型分析1.实验依据：1.1.细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。1.2.染色体是组成细胞核的基本物质,是基因的载体。人类细胞遗传学研究的主要对象是染色体。本实验采用了微量全血培养技术，既方便又节省人力物力。在正常情况下,人外周血中是没有分裂相的,只有在异常情况下才能发现。植物血细胞凝集素(PHA)是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂,在PHA作用下,原处于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞,进而进行有丝分裂。利用PHA这一特性,淋巴细胞经过含有PHA培养液培养,在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体,终止分裂中期的淋巴细胞,经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的中期有丝分裂细胞。最后经空气干燥法制片，便可得到质量较好的染色体标本。即可得到所需的人体染色体图形。染色体组型，又称核型，是指将动物、植物、真菌等的某一个体或某一分类群（亚种、种、属等）的体细胞内的整套染色体，按它们相对恒定的特征排列起来的图像。核型模式图，是指将一个染色体组的全部染色体逐个按其特征绘制下来，再按长短、形态等特征排列起来的图像。染色体组型分析就是通过对染色体标本和其照片进行测量、对比分析、配对、分组、排列，对各染色体的形态进行分析。在细胞遗传学、现代分类学、生物进化和遗传育种学等研究中，是重要的研究手段。 1.3.对于任何一个染色体的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。其中22对是男女共有的染色体，一对为男女所不同的性染色体，男XY,女XX。表-1人类染色体组型群组号染色体号形态大小着丝粒位置随体次缢痕鉴别程度A1~3最大M无常见1号可鉴定B4~5次大Sm无不易C6~12+X中等Sm无常见9号难鉴定D13~15中等St有偶见13号难鉴定E16~18较小16m,17m和18m无常见16号可鉴定F19~20小M无不易G21~22+Y最小st有、Y无难鉴定正常男性染色体核型正常女性染色体核型 3、实验仪器试剂及材料：3.1.材料：人的静脉外周血.（组内选取男女各一名，取血样）3.2.试剂：RPMI-l640培养粉NaHCO3NaClPHA(植物血球凝集素)肝素青链霉素小牛血清秋水仙素95%酒精冰乙酸甲醇甘油Giemsa粉末3.3.器材：恒温培养箱,电冰箱,高压灭菌锅,离心机,真空泵,分析天平,显微镜,超净工作台,注射器,离心管,培养瓶,试管架及试管,量桶,烧杯,酒精灯,抽滤瓶,G6型号细菌过滤漏斗，染缸，滴管等。4、实验方法：4.1.各种试剂及培养基的配制(1)RPMI-1640基础培养基的配制：称取RPMI-l640培养粉9.8g溶于1,000mL蒸馏水中,经G6型号细菌过滤漏斗中0.22微米的滤膜抽滤后备用。使用前最好做热源培养以确保实验顺利进行。(2)5%NaHCO3的配制：称取5gNaHCO3,溶于100mL蒸馏水中,高压灭菌备用.(3)生理盐水的配制：称取0.85gNaCl溶于l00mL蒸馏水中高压灭菌备用.(4)PHA(植物血球凝集素)的配制：称取PHA50mg配制成浓度为lmg/mL(生理盐水配制)的溶液.由于PHA使用量较少,配制时使用注射器式无菌过滤器,以减少药品损失.(5)肝素溶液的配制：40ml生理盐水溶解粉末160mg（每mg含126单位），配制成500单位/ml，8磅15min灭菌。(6)双抗溶液的配制：将青链霉素用生理盐水按效价单位配成l0万单位/mL,配制过程要求使用注射器式无菌过滤器.(7)秋水仙素溶液的配制：用生理盐水配制成浓度为40（微克/mL）秋水仙素溶液,使用注射器式无菌过滤器进行除菌操作.(8)低渗液溶液的配制：称取5.59gKCl溶于1000mL双蒸馏水中,配制成溶液浓度为0.075mol/L的低渗液溶液.(9)细胞培养基的配制：在每个培养瓶中加入RPMIl640基础培养基4mL,小牛血清lmL,肝素3滴（0.03ml）,PHA4滴（0.4ml）,加入双抗5滴（0.05ml）,NaHCO3调pH至7.2～7.4.（10）固定液的配制：9ml纯酒精+3ml冰乙酸（11）Giemsa（吉姆斯）染液（不用配）Giemsa原液配制：称Giemsa粉末0.5g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。56℃中保温90～120min。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存。4.2实验操作方法1、实验所用药品及器皿的无菌处理(1)实验用的所有器皿,器具都必须按规定洗净,高压灭菌处理备用.(2)实验用全部药品都要经高压灭菌或过滤除菌处理.具有生物活性的药品要经G6型号细菌过滤漏斗抽滤除菌,其它药品可经过高压灭菌。2.采取血样：去校医院取本组男生和女生各2份血样。在无菌条件下，向含有3mlRPMI-1640培养基的培养瓶中接种0.18ml全血，轻轻摇匀。3.血细胞培养：将4瓶装有血细胞的培养瓶置于37℃培养箱中培养66～72h（在培 养期间每天摇动两次），终止培养前3～4h加入秋水仙素15ml，使最终浓度为0.4～0.8ug/ml。4.收集细胞：将培养瓶从温箱取出，用吸管将贴壁细胞冲散均匀，按下表将液体分装在相应的离心管中，以1000rpm/min离心8min，弃上清液。管号低渗处理时间男120min女120min男2男2①20min男2②25min女2女2①20min女2②25min5.低渗处理：先加入1ml0.075mol/LKCl溶液，轻轻吹打，使细胞重悬，然后补加6mlKCl溶液，37℃低渗20min。（使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察）6.预固定：沿管壁慢慢加入1ml新配carnoy氏固定液，轻轻吹打混匀，1000rpm/min离心8min，去上清液。7.固定：沿管壁慢慢加入6ml固定液，固定两分钟后再吹打，用吸管轻轻地吹打，使细胞分散，固定20min，离心去上清夜。8.重复固定：取上清液，再重复进行7过程。9.滴片：沉淀物中加入6滴固定液，用吸管吹打使其成为细胞悬液；用镊子取预先冰冻的干净载玻片，迅速滴上2～3滴细胞悬液，立即用嘴向同一方向吹气，使细胞分散均匀，然后置酒精灯上微微加热干燥（或空气干燥）。10.染色：滴有细胞悬液的载片反扣在染色板上，使片、板之间有一缝隙，将稀释后的Giemsa染液滴在片隙中，染色20min（或放于染缸中）；自来水冲洗，吹干。11.镜检：在低倍镜找到处于中期分裂相的细胞，然后在转至高倍镜下观察.观察时要使用推进器座标尺记录分散良好的细胞位置，便于重新查找，选择染色体分散好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微观察。人类每个体细胞有46条染色体，根据染色体的长度和着丝粒位置的不同，可以分成22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。12.染色体组型分析：(1)在显微镜下找出染色体分散良好、长度适中、姐妹染色单体清楚的中期分裂相进行显微拍摄。(2)将显微拍摄放大的照片上的一个细胞的全部染色体分别一条一条剪下。(3)根据染色体的长短和形态特征进行同源染色体的目测配对。(4)测量出每条染色体短壁和长臂长度，计算出各条染色体的相对长度、着丝粒指数、臂指数，记录原始数据。(5)根据测量数据校正目测配对排列结果，进行调整排列。(6)把染色体按一定顺序一对一对的排列，排列时注意短臂向上，长臂向下，性染色体单独排列，最后把染色体贴成一完整的染色体核型图。(7)翻拍。5．实验结果及分析5.1.本实验采用国际标准，使用两种方法，依照上表各指标分析染色体组型，拟图，结果如下 男性染色体核型（PS）女性染色体核型（PS）男性染色体核型（手工）女性染色体核型（手工） 5.2.数据处理：见下表男性染色体长臂短臂臂指数着丝粒指数长度总长相对长度臂判断着丝粒判断11.181.11.0727272730.48245612.2872.010.031662269中中21.451.151.2608695650.44230772.672.010.036106096中中31.080.931.1612903230.46268662.0172.010.02791279中中41.080.871.241379310.44615381.9572.010.027079572中中50.880.851.0352941180.49132951.7372.010.024024441中中60.80.741.0810810810.48051951.5472.010.021385919中中71.250.731.7123287670.36868691.9872.010.027496181亚中亚中81.350.721.8750.34782612.0772.010.028746007亚中亚中91.340.81.6750.37383182.1472.010.029718095亚中亚中101.270.761.6710526320.37438422.0372.010.028190529亚中亚中111.260.751.680.37313432.0172.010.02791279亚中亚中121.230.731.6849315070.3724491.9672.010.027218442亚中亚中131.230.731.6849315070.3724491.9672.010.027218442亚中亚中141.210.691.7536231880.36315791.972.010.026385224亚中亚中151.20.552.1818181820.31428571.7572.010.02430218亚中亚中161.180.61.9666666670.33707871.7872.010.024718789亚中亚中171.190.71.70.37037041.8972.010.026246355亚中亚中181.150.681.6911764710.37158471.8372.010.025413137亚中亚中191.130.661.7121212120.36871511.7972.010.024857659亚中亚中201.10.631.7460317460.36416181.7372.010.024024441亚中亚中211.090.651.6769230770.37356321.7472.010.024163311亚中亚中220.90.461.9565217390.33823531.3672.010.018886266亚中亚中230.80.451.7777777780.361.2572.010.0173587亚中亚中240.60.320.33333330.972.010.012498264亚中亚中251.30.43.250.23529411.772.010.023607832亚端亚端261.20.340.21.572.010.02083044亚端亚端271.20.442.7272727270.26829271.6472.010.022774615亚端亚端281.230.462.6739130430.27218931.6972.010.023468963亚端亚端291.190.432.767441860.26543211.6272.010.022496875亚端亚端301.10.412.6829268290.27152321.5172.010.02096931亚端亚端310.870.61.450.40816331.4772.010.020413831中中320.970.561.7321428570.36601311.5372.010.021247049中中330.650.571.1403508770.46721311.2272.010.016942091中中340.70.61.1666666670.46153851.372.010.018053048中中350.810.61.350.42553191.4172.010.019580614亚中亚中360.790.51.580.38759691.2972.010.017914179亚中亚中370.550.421.309523810.43298970.9772.010.013470351中中380.670.451.4888888890.40178571.1272.010.015553395中中 390.470.4710.50.9472.010.013053743中中400.550.511.0784313730.48113211.0672.010.014720178中中410.960.146.8571428570.12727271.172.010.015275656亚端亚端420.760.116.9090909090.12643680.8772.010.012081655亚端亚端430.620.096.8888888890.12676060.7172.010.009859742亚端亚端440.60.096.6666666670.13043480.6972.010.009582002亚端亚端4510.561.7857142860.35897441.5672.010.021663658亚中亚中460.80.136.1538461540.13978490.9372.010.012914873亚端亚端女性：染色体长臂短臂臂指数着丝粒指数长度总长相对长度臂判断着丝粒判断11.050.91.1666666670.46153851.9548.610.039409863中中21.050.951.1052631580.4752.0048.610.040420372中中31110.52.0048.610.040420372中中40.90.910.51.8048.610.036378335中中50.90.81.1250.47058821.7048.610.034357316中中60.80.751.0666666670.4838711.5548.610.031325788中中71.10.52.20.31251.6048.610.032336297亚中亚中810.42.50.28571431.4048.610.02829426亚中亚中910.452.2222222220.31034481.4548.610.02930477亚中亚中100.90.4520.33333331.3548.610.027283751亚中亚中110.850.51.70.37037041.4048.610.02829426亚中亚中120.850.51.70.37037041.5048.610.030315279亚中亚中130.80.451.7777777780.361.3048.610.026273242亚中亚中140.80.451.7777777780.361.2048.610.024252223亚中亚中150.70.41.750.36363641.1048.610.022231205亚中亚中160.80.420.33333331.2048.610.024252223亚中亚中170.70.41.750.36363641.1048.610.022231205亚中亚中180.70.41.750.36363641.1048.610.022231205亚中亚中190.70.41.750.36363641.1048.610.022231205亚中亚中200.70.41.750.36363641.1048.610.022231205亚中亚中210.670.391.7179487180.36792451.1048.610.022231205亚中亚中220.650.381.7105263160.3689321.1048.610.022231205亚中亚中230.50.31.6666666670.3750.9048.610.018189167亚中亚中240.550.351.5714285710.38888890.8548.610.017178658亚中亚中250.90.1850.16666671.0848.610.021827001亚端亚端260.880.175.1764705880.16190481.0548.610.021220695亚端亚端270.60.096.6666666670.13043480.6948.610.013945028亚端亚端280.690.16.90.12658230.7948.610.015966047亚端亚端290.660.16.60.13157890.7648.610.015359741亚端亚端300.650.16.50.13333330.7548.610.015157639亚端亚端 310.50.31.6666666670.3750.8048.610.016168149亚中亚中320.50.2520.33333330.7548.610.015157639亚中亚中330.450.251.80.35714290.7048.610.01414713亚中亚中340.450.251.80.35714290.7548.610.015157639亚中亚中350.40.220.33333330.6548.610.013136621亚中亚中360.350.21.750.36363640.6048.610.012126112亚中亚中370.350.31.1666666670.46153850.6548.610.013136621中中380.30.310.50.6048.610.012126112中中390.30.251.20.45454550.5548.610.011115602中中400.30.310.50.6048.610.012126112中中410.40.140.20.5548.610.011115602亚端亚端420.40.140.20.5048.610.010105093亚端亚端430.40.140.20.4048.610.008084074亚端亚端440.40.140.20.5548.610.011115602亚端亚端450.80.451.7777777780.361.2548.610.025262732亚中亚中460.80.451.7777777780.361.3048.610.026273242亚中亚中5.3.根据上面的实验图示以及实验数据可知：论采用何种方式处理方式（PS或手工），均得到相同的人体染色体组型，人体正常细胞核型含46条染色体，相互配对成23对。其中22对为男女共有的常染色体。另一对男XY，女XX为男女所独有的，决定性别的性染色体。5.4.实验细胞培养过程中，每个培养瓶中均出现血细胞凝集现象，定期的摇动可以将其分散。然而男1培养瓶由于摇动的时间以及次数比较少，出现了凝集成血块状的沉淀，但是并没有对实验结果产生严重影响。在后期的试验中仍可拍到很好地图像,如上图男性染色体核型(ps）所示.5.5.根据实验所拍到的图像可得知，女2②号、男2②培养瓶所拍到的染色体的分散程度比其他培养瓶的较好。表明低渗的处理时间会对染色体的分散程度产生影响，低渗25min的效果比低渗20min的效果好。5.6.相比其他组所拍到的染色体，我们组的染色体明显较短。原因是①其他组加入秋水仙素的时间比我们早，他们的染色体大多是处于分裂晚前期和早中期；②我们组加的秋水仙素的量比较多，对染色体产生了影响。6．影响实验的事项：6.1.外周血的采集：采血接种时不要加入太多的肝素。肝素过多可能引致溶血和一些淋巴细胞转化和分裂。接种时，若血液过少，获得的淋巴细胞少；而接种过多，淋巴细胞增殖不良，染色体稀少。6.2.培养基：培养基的质量在影响染色体质量方面最为关键，从营养不良的培养基中获得的细胞所制备的染色体质量差，不利于染色体核型分析。6.3.细胞培养：细胞培养阶段也是极为关键的一步，细胞的旺盛生长与培养时间、温度、CO2浓度等条件。培养时间以（72±2）h为宜，时间过长或过多，得到的染色体质量都不符合要求。淋巴细胞培养的适宜温度为（36±0.5）℃，偏离这一温度范围，细胞的正常代谢会受到影响，甚至死亡。如果温度高于37℃,细胞的生长速度减慢；如果温度高于40℃，细胞受损，超过43℃，则导致细胞死亡。气体是人体细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有O2、CO2。CO2既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。大多数细胞的适宜PH为7.2～7.4,培养基的PH值也应调整到7.2～7.4偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。偏酸性时细胞发育不良， 偏碱性时细胞会出现轻度固缩。培养箱的温度和CO2浓度应严格控制在(37±0.5）℃、5％以获得良好的中期分裂相。6.4.秋水仙素与作用时间：秋水仙素作为细胞培养中的纺锤体阻断剂，可使分裂象细胞停留在分裂中期而获得大量分裂中期染色体以便于核型分析。加入秋水仙素的剂量、作用时间与处于分裂中期细胞数量、染色体长短密切相关。加入的秋水仙素过量、作用时间过长，染色体浓缩，不利于分析；若加入的秋水仙素量不足、作用时间过短，则染色体细长或无染色体，同样不利于核型分析。只有适量的秋水仙素与适量的作用时间，才能获得较好的分裂象。6.5.离心力与低渗时间：将培养物收集到15ml的离心管中，通过离心获得需要的细胞。整个过程中，离心力的大小很关键。离心力过大会导致细胞之间粘连过紧，低渗时细胞不能被充分混匀，影响低渗效果。用渗透压很低的盐溶液或蒸馏水处理活细胞，使得细胞长大而不破裂，使得最后制成的片子染色体充分散开。低渗处理的时间过长或过短，都不利于后期染色体的分散，一般以20～25min分钟为宜。【参考文献】1、李国珍：染色体及其研究方法.科学出版社.1985.第170-176页2、刘国章等：1987.遗传，9(3):26-27.3、陈心陶:医学寄生虫学(修订第二版).人民卫生出版社.1965.第330-333页.4、李红燕，王金富．禽类染色体组型研究进展【J】.畜牧生产.2006．15(3)：25-27.5、吴艳萍.核型异常与疾病关系的分析【J】.现代预防医学．2007，34(18)：34(80)6、雷雪芹,孙美玲，雷初期，等．安哥拉山羊染色体核型分析【J】畜牧兽医杂志.2001．20(6)：10-11．7、翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学(第三版).高等教育出版社.2011.12.