艾滋病抗体检测技术免疫印迹法及质量控制黎俊宏

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1、艾滋病抗体检测技术（免疫印迹法）及质量控制黎俊宏检测检验中心艾滋病确证实验室常州市疾病预防控制中心ChangzhouCenterforDiseaseControlandPrevention全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）第六章艾滋病病毒感染实验室检测策略我国自上世纪80年代发现第一例艾滋病病例至今，各地市艾滋病感染者呈逐年增长趋势。4临床诊断相关的检测策略及结果报告4.1使用抗体检测试剂的检测流程：4.3补充试验检测策略补充试验分为抗体确证试验和HIV-1核酸试验。抗体确证试验包括免疫印迹试剂（WB）和条带/线性免疫试验（RIBA/LIA），特定条件下的替代检测（

2、三种酶联免疫试验、三种快速试验或者酶联免疫加快速试验），免疫层析或免疫渗滤试验。HIV-1核酸试验包括定性和定量试验。*两种试剂可以是原有试剂加另一种试剂，也可以是两种不同试剂。全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）第六章艾滋病病毒感染实验室检测策略全国艾滋病检测技术规范（2015年修订版）第六章艾滋病病毒感染实验室检测策略HIV确证试验的方法2314LIA条带免疫试验RIPA放射免疫沉淀试验IFA免疫荧光试验WB免疫印迹试验HIV抗体WB试验具有很高的敏感性和特异性，是国内HIV抗体确证的金标准。RIBA/LIA条线/线性免疫试验WesternBlot与Souther

3、n或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。WB的原理WB检测HIV抗体的原理硝酸纤维试剂膜条上结合了天然灭活的HIV-1型病毒蛋白的分离颗粒和特异性的HIV-2型合成多肽。

4、在膜条分别加入稀释的血清或血浆样本或对照，孵育。如果样本中含有HIV-1和HIV-2型的特异性抗体，则抗体会与试剂膜条上的HIV-1蛋白和HIV-2多肽结合，通过清洗去除试剂膜条上的未结合物，与HIV蛋白特异性结合的抗体再通过与带有碱性磷酸酶的羊抗人IgG抗体结合，加入BCIP/NBT底物等一系列反应即可显色。全病毒裂解液电泳得到的膜条在HIV颗粒中，外膜蛋白（env）基因编码的一个蛋白经糖基化后形成包膜蛋白前体（gp160），其在蛋白酶作用下裂解成外膜蛋白（gp120）和跨膜蛋白（gp41）；核心蛋白（gag）基因编码的前体蛋白（p55）被蛋白酶裂解为衣壳蛋白（p24）和

5、内膜蛋白（p17），p39为p55的碎片；逆转录酶蛋白（pol）基因编码的逆转录酶（p66、p51）和核酸内切酶（p31），而机体对上述HIV蛋白产生相应的抗体，又在WB中出现相应的不同组合的带型。这既是确证HIV抗体阳性的条件，又能作为HIV感染期和AIDS期的参考依据。HIV模型图脂双层膜gp120gp41包膜糖蛋白p24衣壳蛋白p17内膜蛋白p7核衣壳蛋白逆转录酶蛋白酶整合酶env编码外膜蛋白gp120跨膜蛋白gp41（包膜蛋白前体gp160为gp41聚合体）env基因的结构及env蛋白gag基因的结构及gag蛋白功能gag基因编码病毒核心蛋白前体蛋白p55（p39

6、为p55的碎片）、衣壳蛋白p24、内膜蛋白p17pol基因的结构及pol蛋白pol基因编码的酶类p66和p51蛋白为逆转录酶p32蛋白则为整合酶P11蛋白为蛋白酶严格遵守实验室标准操作程序(SOP)确证试验的要点严格按照试剂盒说明书操作严格控制防止样品间的交叉污染试剂MP生物医学亚太私人有限公司（MP）HIV-1/2混合型试剂（MPHIVBLOT2.2）上海英旻泰生物技术有限公司（IMT）HIV-1/2混合型试剂（IMTHIV-1/2Blot）实验蓝图实验原始记录结果的判定首先要确定可见到标本质控带.如果标本质控带是阴性,则检测无效;因为这表示技术上有错误,如未加样本,

7、酶结合物或底物液。与强和/或弱阳性对照试剂膜对照,确定检测试剂膜上每一条带的分子量。按照试剂盒说明书判定标准，判断待测样品为阳性、阴性或不确定。HIV-1抗体阳性检测出2条env带（gp160/gp41和gp120）及gag（p17，p24，p55）或pol（p31，p51，p66）HIV抗体阴性没有病毒的特异性条带或只检测出p17抗体HIV抗体不确定出现任何病毒特异条带，但不足以判断为阳性试剂盒说明书技术规范（2009版）HIV-1抗体阳性至少有2条env带（gp41和gp160/gp120）出现，或至少1条en