海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析

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1、海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析摘要：为了更有效地保护、管理和繁育缅甸蟒（Pythonbivittatus）濒危物种，有必要利用分子技术对地方物种多样性和遗传分化进行研究。试验采用TA克隆双向测序方法对来自海南的37条缅甸蟒和来自越南的28条缅甸蟒部分控制区II序列进行了测定。结果表明，两个地理群体共分为25个单倍型，单倍型多样度（Hd）为0.877±0.025,核苷酸多样性（Ji）为0.00476±0.00041，平均核苷酸差异数（k）为2.676，显示缅甸蟒整体遗传多样性不高；通过比较

2、两群体遗传多样性，发现海南缅甸蟒的单倍型多样度要高于越南缅甸蟒，但核苷酸多样性和平均核苷酸差异数低于越南缅甸蟒;基于控制区构建ML树和Network网络分析显示，两群体均各自形成了明显的两大分支；通过海南计算得到两群体的固定指数（Fst）为0.201（P岛位于中国南部，与越南隔海相望。岛屿具有与陆地界限明确、受陆地物种影响小等独有特点，因此是研究物种进化、演替和新物种形成的绝好地理环境。海南岛蟒蛇具有这些特征。目前，关于越南缅甸蟒线粒体基因组全序列和来自海南缅甸蟒线粒体基因组全序列已经公布［6］，通过比对发

3、现其在控制区II位置变异最大。此外，人们在饲养过程中，发海南与越南缅甸蟒线粒体控制区遗传多样性及差异性分析摘要：为了更有效地保护、管理和繁育缅甸蟒（Pythonbivittatus）濒危物种，有必要利用分子技术对地方物种多样性和遗传分化进行研究。试验采用TA克隆双向测序方法对来自海南的37条缅甸蟒和来自越南的28条缅甸蟒部分控制区II序列进行了测定。结果表明，两个地理群体共分为25个单倍型，单倍型多样度（Hd）为0.877±0.025,核苷酸多样性（Ji）为0.00476±0.00041，平均核苷酸差异数（

4、k）为2.676，显示缅甸蟒整体遗传多样性不高；通过比较两群体遗传多样性，发现海南缅甸蟒的单倍型多样度要高于越南缅甸蟒，但核苷酸多样性和平均核苷酸差异数低于越南缅甸蟒;基于控制区构建ML树和Network网络分析显示，两群体均各自形成了明显的两大分支；通过海南计算得到两群体的固定指数（Fst）为0.201（P岛位于中国南部，与越南隔海相望。岛屿具有与陆地界限明确、受陆地物种影响小等独有特点，因此是研究物种进化、演替和新物种形成的绝好地理环境。海南岛蟒蛇具有这些特征。目前，关于越南缅甸蟒线粒体基因组全序列和来

5、自海南缅甸蟒线粒体基因组全序列已经公布［6］，通过比对发现其在控制区II位置变异最大。此外，人们在饲养过程中，发现同齡海南缅甸蟒与越南额甸蟒在个体大小和生长速度上有显著性差异，因此有必要利用分子技术探讨这两种缅甸蟒遗传差异。国内外学者利用线粒体上控制区、CYTB以及微卫星标记对缅甸蟒遗传多样性进行了研究［7-9］，取得了一定的研究成果，对于地方种群的来源、结构、种群多样性以及对入侵种群的管理有一定的参考价值，但目前关于海南缅甸蟒种群遗传多样性的研究国内外尚未见报道。为了更有效地保护、管理和繁育缅甸蟒濒危物种

6、，特别是海南缅甸蟒，有必要采用现代分子遗传技术对种群进行群体遗传结构、遗传分化分析。本试验通过测定中国海南岛和越南的缅甸蟒控制区II3'端序列，研究两地方种群缅甸蟒遗传多样性，探讨海南与越南额甸蟒遗传结构及遗传差异，以期能为海南和越南铜甸蟒的正确区分提供重要的科学依据。1材料与方法1.1样本采集本试验从海南蟒蛇研究所的10000条蟒蛇中随机抽取海南缅甸蟒37条、越南缅甸蟒28条，采用心脏采血法每条抽取1.5mL血液，柠檬酸钠抗凝，立即提取总DNA（参照天根DP304离心柱型基因组提取试剂盒说明书操作），检测

7、样品浓度和纯度，并稀释至100ng/uL,-20°C分装保存。1.2PCR扩增及克隆测序PCR扩增引物，上游引物序列为：5'-CTCCGAATAAATCCCAATC-3’；下游引物序列为：5'♦CTTGTTGCCGCTTCTGTGG-3，。PCR扩增体系为50uL：TaqMasterMix混合液25uL，总DNA模板100ng，最后补水至50uLoPCR反应程序为：94°C预变性3min;94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸1min,30个循环；72°C延伸5min。PCR产物经1%凝胶电泳

8、检测，回收目的条带。将目的条带进行克隆测序。具体步骤：T4DNA连接酶作用下16°（2过夜一连接至PMD20-T载体一转化至大肠杆菌DH5a—LB培养基培养12挑取阳性克隆菌落-*菌落PCR验证提取质粒—生工生物工程（上海）股份有限公司ABI3730型全自动测序仪双向测序。1.3序列分析所得序列用DNASTAR7.10中的SeqManll进行序列校对及拼接。用BioEdit7.0软件进行多重比对，DnaSP3.0