子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程中微小rna差异表达普及其对细胞周期调控

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1、.....子宫内膜基质细胞体外蜕膜化过程中的微小RNA差异表达普及其对细胞周期的调控子宫内膜基质细胞(ESC)的蜕膜化过程对于胚胎的成功着床和妊娠的建立和维持起着重要作用。虽然对此过程的分子机制尚未明确,但现阶段的研究认为,局部的诱导因子和细胞周期调节因子影响ESC的增殖和分化。近年来许多研究发现,微小RNA(miRNA)参与了哺乳动物细胞的生长、分化、凋亡、免疫调节及疾病发生等生物学过程,并且已经功能性整合参与许多关键细胞的周期控制.因此,本研究采用miRNA微阵列芯片技术筛选miRNA差异表达谱,探讨血RNA在子宫内膜蜕膜化过程中的作用和调控机制,为人

2、胚胎着床机制的研究提供新的思路。材料与方法一、材料来源1,细胞来源:子宫内膜取自2010年1至5月在郑州大学第一附属医院生殖医学中心行体外受精-胚胎移植(IⅤF-ET)的11例患者。患者为因男方因素不育或输卵管性不育,月经周期28~30d,年龄25~35岁,排除子宫肌瘤、子宫内膜异位症(内异症)、子宫内膜炎、子宫畸形等生殖系统疾病及其他合并症,且近3个月内无激素服用史,标本取自月经第I天诊刮所得子宫内膜,行原代培养后传至第3代,并经过测定角蛋白和波形蛋白鉴定。..........2.主要试剂:无酚红DMEM培养液和经碳-葡聚糖吸附(DCC)处理的胎牛血清(

3、FBS)均购自美国Gibico公司;I型胶原酶、8-溴-环磷酸腺芾(8-Br~cAMP)粉剂和醋酸甲羟丙孕酮(MPA)粉剂均购自美国sigma公司;RNA抽提试剂盒购自美国MRC公司;月旨质体hpo凭damille2000购自美国Invitrogen公司;Hsa~miR-222抑制物和异硫氰酸荧光素(FITC)-阴性对照购自上海吉玛制药技术有限公司;逆转录(RT)酶试剂盒购自立陶宛MBIFcrmentas公司。二、方法1.原代ESC的培养和体外蜕膜化:内膜组织用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次后,用剪刀剪碎,短暂离心后加入0,1%I型胶原酶37℃消化1h,娴0

4、目筛网过滤,滤过的细胞为EsC,离心后加入含10%FBS的DMEM培养液。用0乃%胰蛋白酶消化传代。贴壁长满的单层细胞用无血清、无酚红的DMEM培养液培养鲳h后,加入含2%DCC-FBS、0.5mmo1/L8溴-cAMP、1umol/LMPA的无酚红DMEM培养液培养0、24、48和96h,进行体外蜕膜化模型(蜕膜化组)的构建;同时用含2%DCC-FBS的无酚红DMEM培养液培养ESC作为对照(对照组):蜕膜化细胞于倒置显微镜(×40)下观察其形态,并测定培养液中催乳素水平。以观察到体内蜕膜细胞形态,催乳素水平升高提示模型构建成功。所用细胞均为第3代ESC

5、,2.miRNA微阵列芯片技术筛选两组ESC中miRNA差异表达谱:血RNA微阵列芯片采用北京博奥生物公司生产的哺乳动物miRNA芯片Ⅴ10、探针数据库为⒌nger..........miRNA数据库,共892条miRNA,所有实验操作参照该公司实验手册进行。蜕膜化组和对照组ESC细胞采用TRIzd试剂盒分别提取'总RNA=通过异丙醇沉淀法浓缩RNA,用分光光度计计量,甲醛变性胶电泳检测总RXA的质量。取50~100g总RNA用聚乙二醇(PEG)方法分离miRNA。利用小牛肠碱性磷酸酶进行miRNA的去磷酸化,然后利用弘RNA连接酶标记方法进行后续的荧光标

6、记。杂交:将RNA溶于161tl杂交液中,杂交炉中42℃过夜。杂交检测:使用特异性荧光标志物Cy3和Cy5,血RNA微阵列芯片用LuxScan10K/A双通道激光扫描仪(北京博奥生物公司产品)进行扫描,采用Luxscm30图像分析软件对芯片图像进行分析,所获得数据用于miRNA差异表达谱的分析。蜕膜化组第4天miRNA表达水平为D4,对照组第4天为C4,差异倍数D4/“)2,0或<0,5为miRNA差异表达。3.实时荧光定量PCR技术检测两组ESC中miRNA的表达:选择在蜕膜化ESC中均下调的两组ESC中miRNA(共H个)进行实时荧光定量PCR技术检测

7、。使用RT酶试剂盒将RNART成cDNA,反应总体系为⒛耐,包括2mgRNA样本。取2.5耐的RT-PCR反应产物作为模板,反应体系为5d,含上、下游引物各2d、DNA荧光染料SYBR⒍cen混合物125ul、缓冲液2.5μl,去离子水5,5μl;在FTC200o型实日寸PCR仪J二进彳亍PCR扩士曾,反应:条件为:g~i℃预变性2血n;%℃变性15s、60℃退火30s、74℃延伸3s,共硐个循环;72℃延伸10min。miR922RT引物序列5′-ACAGCTAcATcTGGcTACTGGG3′。溶解曲线采用解离曲线软件包处理,确保扩增产物仅有l个,使用

8、3%琼脂糖变性凝胶电泳检测。采用相对定量2-ΔΔct方法进行计算分