槐定碱致痫大鼠大脑皮质erk通路相关蛋白表达的变化

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1、槐定碱致痫大鼠大脑皮质ERK通路相关蛋白表达的变化：段慧云，张琳娜，陈晓霞，胡淑婷，白洁【摘要】目的探讨槐定碱致痫大鼠大脑皮质中细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)信号通路相关蛋白的表达变化及其意义。方法将42只健康SD大鼠随机分为正常组、癫痫组和苯巴比妥钠(phenobarbitalsodium，PBS)治疗组。癫痫组腹腔注射槐定碱(Sophoridien，SRI)建立癫痫大鼠模型，应用免疫组化染色方法观察各组大鼠大脑皮质ERK1、ERK2和p-ERK1/2的蛋白水平表达变化，应用HE染色方法观察各组大鼠大脑皮质病理学改变。结果正常大鼠皮质有少量的ERK1和ERK2

2、表达；致痫0.5h后p-ERK1/2开始表达，并且ERK1和ERK2阳性细胞数较正常组开始增多(P＜0.01)，致痫1.5h后三者表达数量达到最高值，5h后表达下降；治疗组阳性细胞表达数量较癫痫组有一定程度的降低(P＜0.05)；与正常组和治疗组相比癫痫组大鼠皮质有明显的变性坏死神经元。结论槐定碱致大鼠癫痫发作后，大脑皮质ERK的活性产生变化，其信号通路可能参与癫痫发作后皮质的病理生理反应过程。【关键词】癫痫；ERK信号转导通路；槐定碱；大鼠槐定碱(Sophoridien，SRI)是从豆科槐树植物苦豆子中分离提纯出来的一种生物碱，属于四环的喹嗪啶类。据有关文献及本

3、教研室前期实验研究发现大剂量的槐定碱有明显的中枢兴奋作用［1］，能引起反复癫痫发作，故利用槐定碱建立了一简单、稳定与人类癫痫相似的急性癫痫动物模型。丝裂原活化蛋白激酶(mitogenactivatedproteinkinase，MAPK)家族的细胞外信号调节蛋白激酶(extracellularsignal-regulatedproteinkinase，ERK1/2)在脑内含量丰富［2］，在神经元的胞体、树突上大量表达，可以将胞外刺激信号如神经递质、神经营养因子、神经生长因子等传至胞内，影响突触重塑、轴突生长和神经元的兴奋性，以及早期快反应基因表达，从而参与神经系统

4、多种疾病的病理生理过程。本研究用槐定碱(SRI)诱发大鼠癫痫模型研究皮质ERK通路相关蛋白的表达，探讨ERK信号转导途径在癫痫发病机制中的作用。1材料与方法1.1实验动物分组健康SD大鼠42只(宁夏医科大学实验动物中心提供)，雌雄不拘，体重180～220g，随机分为正常组6只、癫痫组和苯巴比妥钠治疗组各18只，后两组按动物存活时间分为0.5、1.5和5h组各6只。1.2药品、试剂与仪器槐定碱(宁夏盐池制药厂生产，批号：021180)；苯巴比妥钠(上海新亚药业有限公司生产，批号：05070)；兔抗ERK1(SantaCruz)、ERK2(SantaCruz)和p-E

5、RK1/2(CellSignaling)和SP免疫组化染色试剂盒均购自北京中杉生物技术有限公司；切片机为Leica公司产品，采用PL-A6XXCamerakit系统获取图像。1.3方法1.3.1模型制备癫痫组腹腔注射槐定碱(47.83mg/kg)；治疗组预先腹腔注射苯巴比妥钠20mg/kg，0.5h后按上述方法加注槐定碱。行为学观察按Racine分级标准，0级：正常行为状态；Ⅰ级：面肌抽动；Ⅱ级：节律性点头；Ⅲ级：单侧前肢阵挛；Ⅳ级：双前肢阵挛伴站立；Ⅴ级：持续站立，失去平衡、跌倒。从出现Ⅲ级发作开始计时，分别在0.5、1.5和5h开始标本制备。1.3.2标本采集

6、各组大鼠于相应时间点经腹腔注射25%乌拉坦125mg/kg麻醉后迅速开胸暴露心脏，沿左心室向升主动脉插管并固定，先快速灌入生理盐水300mL冲洗血液，至右心耳流出无色透明液体时换4%多聚甲醛戊二醛混合溶液500mL约1h进行内固定，四肢、尾阵挛直至僵直。断头取脑置入相同固定液中后固定24h，石蜡包埋后作连续冠状切片，片厚5μm，每隔5张取2片，每例标本取片不少于8张。裱于经防脱片处理的清洁载玻片上待用。1.3.3免疫组织化学染色观察(SP法)和HE染色免疫组织化学染色SP法按试剂盒说明进行操作，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。用PBS代替一抗作为阴性

7、对照。阳性细胞数的计数方法为：每只大鼠取2张切片，两侧分别计数，每侧观察5个高倍视野，每个高倍视野计数大脑同一层面皮质阳性细胞数，以胞浆或胞核染成黄色或棕色为阳性，取其均值。此外每只大鼠各取一张切片按常规方法进行HE染色，光镜下观察。1.4统计学方法数据以(±s)表示。用SPSS13.0软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。2结果2.1各组动物行为学观察正常组大鼠活动正常，治疗组表现安静，无癫痫发作。癫痫组大鼠在大剂量槐定碱腹腔注射后经6～10min的潜伏期后，开始出现须动、点头和咀嚼样动作，呈阵发性，至

8、0.5h左