上海科技兴农重点攻关项目

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1、上海市科技兴农重点攻关项目课题建议书课题归类种源农业（）装备农业（）生态农业（√）数字农业（）课题名称基于工程酵母表达的基因克隆鸡体内GAL-6抗菌肽的研制建议单位上海高龙生物科技有限公司地址上海松江工业区书海路1505号电话67760682建议人王奎明手机13614118729必要性（200字内）GAL-6蛋白是一种在鸡的食道、嗉囊中高度表达，在腺胃中适度表达的β-抗菌肽。作为一种内源性抗菌肽，GAL-6蛋白具有广谱抗菌功能，能够有效抑制空肠弯杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌等多种主要食物源性病原体；杀菌曲线显示GAL-6在6分钟内能够显著降低C型产气荚膜梭菌的存活率。对真菌、病毒及癌细胞也有

2、一定的抑杀作用。其热稳定性好、水溶性好、抗菌机制独特、对动物正常细胞无害，具有成为优良饲料添加剂的潜质。本课题拟在已在原核系统成功表达鸡β－防御素基因的基础上，进一步构建重组酵母表达载体，并获得表达该基因的工程酵母。为微生态绿色饲料添加剂生产提供技术支持。技术可行性（600字内，重点阐述主要研究内容、创新点、关键技术及指标）研究内容：1)毕赤酵母pPIC9K-GAL-6表达质粒的构建：以克隆质粒pGEM-3Zf（-）GAL-6为模板，用上、下游引物通过扩增GAL-6基因。2)电转化毕赤酵母及筛选多拷贝阳性克隆：用SalⅠ酶切重组质粒pPIC9K-GAL-6，使其完全线性化，30℃静置培养至长出

3、单克隆菌落。3)PCR法鉴定：在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆（约107个细胞）至20μL0.25%SDS溶液中，混匀后90℃加热3min，离心后取1μL上清作模板，用上、下游引物进行PCR反应。根据PCR结果酶切后电泳鉴定重组质粒。4)重组GAL-6的纯化和鉴定。4创新点：1)本项目研发一种安全、有效的饲料抗生素替代物-抗菌肽(GAL-6)的生产工艺和使用工艺，以现代生物技术方法工业化大规模生产GAL-6蛋白，以减少饲料中添加的抗生素，消除因食用含有抗生素的食品而对人类健康造成的危害，确保养殖业的健康发展，保障食品安全。2)在毕赤酵母中成功进行GAL-6基因的高效表达，经纯化后的目的蛋

4、白产量高于酿酒酵母几十倍。3)自行研发全面优化的动物饲料抗菌肽的大规模生产化发酵培养和纯化工艺。4)采用拥有自主产权的饲料表面喷涂技术，使得该产品能通过颗粒饲料的高温、高压高湿制粒过程的蛋白活性不被破坏。关键技术：利用基因重组技术，将动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf（-）GAL-6为模板，用PCR方法获得GAL-6基因，构建表达质粒pPIC9K-GAL-6并转化毕赤酵母。经多级放大培养至中试生产后，全面优化发酵培养条件，放大到生产化发酵培养，经纯化后的高纯度、活性好的GAL-6蛋白，用特殊喷涂方法喷晒在动物饲料表面，以取代动物饲料抗生素。技术指标：1）重

5、组后的pPIC9K-GAL-6质粒的鉴定；2）表达的目的蛋白鉴定和活性检测；3）动物模型的有效性实验研究；4）中试生产的培养密度和得率的最大量化的指标；5）喷晒在动物饲料表面蛋白的活性鉴定；6）生产化培养密度和得率的最大量化的指标；7）形成有自主知识产权的高效抗生素替代物-动物饲料抗菌肽的生产工艺和使用工艺。起止日期2011-01至2012-12经费及用途（可附页）80万元主要参加人员情况简介1)钟诚博士：1990年获美国俄勒岗州立大学家禽系哲学博士学位；1991年在美国特拉华大学做博士后，在美国参与或主持过数项重大的科研项目并取得成果；1992年起在美国数家大公司任职，曾在中美合资企业任技术

6、总经理及其他高级管理职务。现担任国龙科技饲料（上海）有限公司、上海高龙生物科技有限公司、国龙药业（济南）有限公司、山东高龙生物科技有限公司和山东国龙生物工程有限公司五家公司董事长及上海高农科生物技术研究中心主任，并被上海4东华大学聘请为客座教授。钟诚担任的社会职务有：东华大学客座教授；中国畜牧兽医学会动物营养学分会理事；上海市饲料工业协会副会长；上海市畜牧兽医学会理事；上海市侨联华商联谊会理事；上海市徐汇区政协委员；上海市徐汇区海联会理事；上海市徐汇区民营科技企业协会第二届理事；科技部专家库，上海市农委专家库等专家；钟诚回国后获得的荣誉有：2003年荣获“上海市优秀留学回国人才”称号；2004

7、年荣获“徐汇区优秀留学回国人才”称号；2004年荣获“徐汇区拔尖人才”称号；2006年荣获“上海市松江区立功竞赛先进个人”称号；2007年被列入“徐汇区领军人才后备队”；2007年荣获“第五届徐光启科技奖章”金奖；2009年荣获全国归侨先进个人；2009年徐汇区优秀中国特色社会主义事业建设者；2009年获上海市归国人士杰出创业奖。1)王奎明博士：副教授，公司研发中心主任。1991年毕业于吉林农业大