上海科技兴农重点攻关项目

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1、上海市科技兴农重点攻关项目课题计划任务书项目名称农业种质资源创新与良种良法配套技术的研究课题名称食用菌重要功能基因的发掘和新品种培育课题编号沪农科攻字（2011）第1-2号起止期限2011年9月1日起至2014年12月31日课题主持单位上海市农业科学院（盖章）课题负责人陈明杰张劲松课题协作单位国家食用菌工程技术研究中心（盖章）上海国森生物科技有限公司（盖章）上海百信生物科技有限公司（盖章）课题主管单位上海市农业科学院上海市科技兴农重点攻关项目管理办公室制填报说明一、本计划任务书应在上海市科技兴农重点攻关项目管理办公室批准立项后，由主持单位填报。二、填写本计划任务书应按要求认真填写各项内容，

2、表达准确，字迹清楚。外来语同时用原文和中文表达。课题主持单位填写时如各档空格不够，请自行加页。三、本计划任务书请采用A4纸双面印刷，普通纸质材料作为封面，不采用胶圈、文件夹等带有突出棱边的装订方式，左侧装订成册。四、课题主持单位填写后，应由主管单位审查并盖章后汇总报送上海市农业科技服务中心，一式五份。五、计划任务书经审定后，即作为课题合同书不可分割的组成部分，附于课题合同书的正副本之中。22一、课题实施主要内容、技术关键和技术路线1、主要内容和技术关键本项目拟定设立两个子课题，分别对草菇、灵芝相关的科学问题展开研究。课题一：草菇交配型系统的分子遗传学研究和稳定转化技术体系的建立本子课题的主

3、要研究内容：根据草菇V23菌株的全基因组序列，明确解析草菇交配型位点的分子遗传学结构。在此基础上，设计交配型基因的分子标记，鉴定草菇同核体和异核体的交配型类型。对100株草菇单孢子萌发菌株所携带的交配型基因进行鉴定，然后通过栽培试验鉴定这些菌株的出菇能力。同时对携带不同交配型基因的单核体进行杂交试验。综合分析上述分子证据和试验数据，确定草菇交配型系统的类型。并在不同草菇品种间开展以交配型基因为分子标记的杂交育种试验。采用电注射法建立稳定的草菇遗传转化体系。构建含目的afp基因（抗冻蛋白基因）的草菇表达载体，采用电注射法把此表达质粒转化进草菇细胞内，在低温条件下筛选转化子，通过PCR和Sou

4、thern杂交对外源afp基因在草菇转化子体内的表达情况进行检测。技术关键：221、草菇单孢分离、原生质体制备及同核体菌株鉴定技术。以草菇V23菌株担孢子为材料，采用平板涂布法分离单孢菌株；以草菇V23菌株菌丝体为材料，利用溶壁酶的分解作用制备原生质体，在这个过程中形成的单核原生质体在再生培养基上再生出细胞壁，从而形成单核菌丝体。通过这种方法获得的单核体由于没有经历减数分裂阶段，不存在重组型的交配型位点结构，具有和亲本菌株相同的交配型基因，有别于通过孢子萌发获得的重组型单核体；由于草菇菌丝不具有锁状联合，不容易进行核型鉴别，通过比较草菇不同单孢分离菌株交配型基因的序列，分析序列的特异性，建

5、立以交配型基因为分子标记的鉴别核型的分子生物学方法，可以对同核体菌株进行快速鉴别。2、电注射法转化草菇技术。真菌转化使用的方法多为原生质体的电转化，CaCl2处理，聚乙二醇或限制性酶切介导整合。上述转化方法主要依赖于麻烦的原生质体制备，因此对于其它食用菌应用性不强。因为其它食用菌可能不能产生足够的可再生的原生质体，而且这种转化在其它实验室里可能是很难重复的。农杆菌介导的转化是一种在大部分的植物上都应用的基因操作的常规方法，并且也已被证明可以将原核生物里的DNA转移到丝状真菌里。然而，这种方法并不是对于所有的食用菌都合适。本研究中，我们采用一种已报道的以担孢子电转化为基础的转化方法，即用溶菌

6、酶温和预处理萌发的担孢子后进行电转化。这种方法没有严重损坏细胞壁的完整性和细胞的生存能力，却能使转化菌株的数量显著增加。此外，这种方法避免了原生质体再生和宿主专一性的问题，因此对于食用菌转化是一种有用的方法。技术路线1：22栽培草菇V23菌株，收集担孢子梯度稀释担孢子，涂布平板萌发后挑取单个菌落液体培养草菇V23菌株，收集菌丝体用溶壁酶处理菌丝体，涂布再生培养基平板PCR分子标记鉴别菌株核型，筛选同核体菌株技术路线2：22草菇抗性标记试剂筛选草菇gus基因表达载体构建电注射法转化gus报告基因转化子的筛选克隆gpd启动子人工合成afp基因Southern测定组织化学测定转化子的鉴定GUS酶

7、活力测定草菇afp基因表达载体构建建立草菇遗传转化体系，稳定条件电注射法转化afp基因观察性状，总结栽培模式转化子筛选Southern测定PCR检测转化子鉴定转afp基因草菇菌株获得课题二：分子辅助定向选育强纤维素降解能力的灵芝品种22本子课题的主要研究内容：以灵芝纤维素强降解能力菌株和弱降解能力菌株为杂交亲本，建立F1代分离群体，以F1代单个子实体的150个孢子单核体为作图群体，构建以SNP为分子标记、可对应于灵芝全基