细菌dna提取方案

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1、细菌DNA提取方案原理要进行重组DNA实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常为基因工程实验所需要(意义)。【大家都知道，作为基因工程的载体必须满足下面四个条件：1.是一个复制子，有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；2.他必须要有很高的复制率，这样才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；3.有限制性内切酶的识别位点，便于外源基因的插入；4.载体具有选择的遗传标识，以此判断载体是否进入受体细胞，并将其分离出来。因此——】基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以

2、此增加外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。对于细菌来说，细菌细胞具有坚硬的细胞壁。提取难度将大于真核细胞。细菌基因组DNA在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽提到大的DNA分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。（温和操作）。另外制备的DNA必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须没有蛋白污染，没有RNA，

3、各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都应考虑到。DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。并且用酒精可以洗脱在前几步实验中使DNA携带的盐离子（如何保证高纯度）。对于细菌而言，有染色体DNA和质粒DNA，因此要将其分离开。处理过程中，细菌染色体DNA缠绕在细胞膜碎片上，离心时容易被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中，上清液中还可能有蛋白质，核糖核蛋白和少量的染色体DNA。大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，

4、SDS具有的主要功能是：（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；（3）SDS能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。SDS也能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。以免影响下一步RNase的作用。破细胞后RNA经RNase消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿—异戊醇抽提除去。含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，回收DNA。此种方法抽提的细菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆等

5、。但在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA浓度的方法，是溴化乙锭电泳法；当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB会增强发射的荧光。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待样品的浓度。本实验利用的就是使用裂解液（含去污剂SDS）将细胞壁破坏，裂解后，用乙醇将DNA沉淀下来。材料：①LB液体培养液②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8

6、—羟基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑制核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/LpH8.0Tris缓冲液抽提，再用0.1mol/LpH8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶液都要带手套，以免损伤皮肤。③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris－Cl(pH7.5)15mmol/LNacl溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装后于－

7、20℃保存。④TEG缓冲液：pH8.025mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,50mmol/L葡萄糖,4mg/mL溶菌酶⑤标准菌株：大肠埃希氏菌⑥碱裂解液：0.2mol/LNaOH,1%SDS⑦乙酸钾溶液、乙酸钠溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。方法与步骤：1)将大肠杆菌接种于LB培养基在37°C环境下，以150r/min震荡过夜培养。2)取1ml对数期菌液，12000rpm5min；3)弃上清，将沉淀溶于200ul丙酮，震荡混匀，冰浴5min。4)8000rpm离心2min，弃上清。5)将沉淀混于TEG缓冲液中，震荡混匀，冰浴5min6)加入2

8、00ulSDS裂解液，冰浴5min7)