姜黄素对血管平滑肌细胞胆固醇蓄积的影响及其与srebp-1活性的关系

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1、实验方法1.细胞培养贴块法进行SD大鼠胸主动脉VSMCs原代培养，倒置相差显微镜下观察，细胞为梭形，具典型峰谷生长状态。待细胞长满后用0.125％的胰蛋白酶传代。取3～8代细胞进行实验。细胞用含有10％胎牛血清DMEM培养液，37℃、5％C02培养箱中静置培养，培养液中加青霉素和链霉素各1．0×105IU/L，待细胞长至80%融合的时候姜黄素处理。细胞在50mg／Lox-LDL中培育48h，转变成荷脂细胞，换含1%胎牛血清DMEM培养液，姜黄素或姜黄素加SREBP-1抑制剂ALLN处理。2.低密度脂蛋白的氧化修饰及鉴定正常人血浆低密度脂蛋白(LDL,密度1.040-

2、1.063kg/L)采用序列超速离心法制备。取未加抗凝剂的健康人新鲜全血200ml，室温下静置1h，弃血凝块，以4℃、5000r/min离心30min，获血清112ml加入NaN322.4mg、10%EDTA0.56ml防腐、防氧化。血清在离心机上作序列超速离心。使用3.9ml密度为1.386的液体调整血清密度为1.19。然后4℃、30000r/min离心18h，吸出上层乳白色液体(VLDL)及次层淡黄色液体(IDL)；收集下层液体140ml，用1.386密度的液体再调整密度为1.063，再4℃、40000r/min离心24h，吸出上层黄色液体，即是LDL。将LDL

3、置于PBS溶液中，4℃透析36h，充分去除EDTA后，用含10μmol/LCuSO4的PBS溶液(pH7.2)，37℃透析20h，进行氧化修饰。氧化修饰后的LDL（ox-LDL）置含100μmol/LEDTA的PBS中，4℃透析24h，终止氧化。超滤除菌，BCA试剂定量蛋白，调蛋白浓度至1g/L用于实验。3.油红O染色将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板，处理结束后，用PBS冲洗盖玻片3次，每次5min，50%异丙醇固定1min，油红O染色液染色10min，蒸馏水冲洗3次，每次1min，苏木素染色5min，分色和返蓝后，水性封片剂封片。显微镜下观察，细胞内脂质

4、呈红色，细胞核呈蓝色，HPIAS-1000型图像分析系统收集图像。4.细胞内胆固醇的检测待细胞处理结束后，弃去培养基，PBS洗3遍，加入0.1mol/LNaOH500μl，反复9冻融3次裂解细胞，BCA试剂定量蛋白后，7.2%三氯乙酸沉淀蛋白，800×g离心10min，留上清进行胆固醇检测。以豆甾醇为内标并作标准曲线，取100μl上清液，加入1.mol/L氢氧化钾溶液200μl，水解CE后为细胞内TC样品，加1mol/LNaOH200μl为FC样品。各样品分别与内标液混匀，用正己烷和无水乙醇抽提后，1.5mol/L的三氧化铬进行氧化衍生并真空干燥，100μl乙晴－异

5、丙醇（80:20）溶解样品，上样于高效液相色谱仪。采用C-18柱，柱温4℃，流速1mL/min，250nm紫外光检测，胆固醇以峰面积定量，内标校准，以μg/mg细胞蛋白为单位。细胞内CE含量为总胆固醇与FC的差值。1.19Western印迹在收获好的细胞中加入三去污剂裂解缓冲液进行细胞裂解，于4℃离心10min，弃除沉淀，BCA法进行蛋白质定量，取30ug蛋白质加入2xSDS凝胶加样缓冲液中，在100℃加热10min以使蛋白质变性．聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，转PDVF膜，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白质分子质量标准位置．封闭液封闭2h，按1：500加入一抗，4

6、Y孵育过夜，TBST洗3次，按1：1000的稀释倍数加入辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育1h，TBST洗3次，用蛋白质印迹荧光检测试剂盒显示于X光片．结果用Labwork凝胶图像分析系统对胶片扫描，以对照组的面积灰度值为100％与实验组进行比较和半定量分析．1.20统计学处理所有数据均用均数±标准差（x±s）表示。用SPSS11.0进行统计处理，组间比较用单因素方差分析(one-wayANOVA)检验，后用最小有意义差异t检验(1eastsignificantdifference，LSD-t)进行均数间的多重比较，以P＜0.05判定差异有无显著性意义。10实验结果一

7、姜黄素对VSMCs胆固醇水平的影响及Caveolin-1表达变化1姜黄素对VSMCs胆固醇水平的影响1.细胞内TC含量的量效变化不同浓度姜黄素（0、6、12.5、25μmol/L）作用于VSMCs12小时,细胞内TC的含量下降(图1)，12.5μmol/L姜黄素处理时总胆固醇含量最低(图3)。250200150** *100500（umol/l）正常DMSO612.525图1姜黄素引起VSMCsTC含量变化的量效关系(x±s;n=3)*P<0.05,vs正常；#P>0.05vs正常.2.细胞内TC含量的时效变化1.19μmol/L姜黄素不同时间（0、3、6、12