类泛素蛋白fat10在肝癌中的表达及生物学作用

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1、类泛素蛋白FAT10在肝癌中的表达及生物学作用［摘要］目的探讨类泛素蛋白FAT10在肝癌细胞中的异常表达和功能活化及其分子机制。方法将38例肝癌大鼠随机分为空白组、pcDNA3.1-FAT10组、FAT10siRNA组。采用RT-PCR法检测肝癌及癌旁组织中FAT10mRNA的表达水平，电穿孔法分别将FAT10siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10转染人肝癌SMMC-7721后，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化。结果FAT10mRNA在大鼠肝癌组织中的相对表达水平明显高于癌旁组织(P［关

2、键词］肝癌；FAT10；电转法；PI3K/Akt信号通路；凋亡［中图分类号］R735.7［文献标识码］A［文章编号］1674-4721(2016)09(a)-0016-03肝癌因其存活率低，发病率高，己成为众多学者关注的对象［1-3］。类泛素是与泛素具有相似功能的蛋白，在结构上与泛素具有部分相同序列。FAT10是一种新发现的，可以通过共价结合发挥泛素样作用的类泛素蛋白［4-6］。其在多种癌细胞如胃肠癌、肝癌等细胞中得以表达［7-10］。因此，本实验先对肝癌及癌旁组织的FAT10进行检测，后将FAT1OsiRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT1

3、0转染肝癌细胞，采用多种方法分别检测细胞周期和细胞凋亡的变化，RT-PCR检测PI3K/Akt通路的变化，旨在为肝癌的治疗提供新的手段。1资料与方法1.1一般资料设计：随机对照动物实验。时间及地点：2014年9月〜2015年12月在沈阳医学院实验室完成。材料及来源：SMMC-7721细胞株购于上海誉贸实业有限公司，由本实验室保存。L-DMEM培养基、胎牛血清和混合抗生素购自GIBCO公司，FAT10siRNA和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10均由上海吉玛公司合成，电穿孔仪，TRIzolReagent购自Invitrogen公司，CCK-8试剂

4、盒购于上海Dojind化学科技有限公司，流式细胞仪购于赛默飞公司，多克隆兔抗体Akt购于Proteintech公司，GAPDH抗体购于Bioworld公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体购自优维宁生物技术公司。1.1RT-PCR检测FAT10表达38例肝癌大鼠开腹，取少量肝癌及癌旁组织粉碎后，加入含1mg/ml亚铁离子的PBS多次反复冲洗，用匀浆器打匀，并过100mm滤膜，备用。吸取2ul的悬浮细胞液，正反向引物各加入1ul悬浮细胞液。反应循环条件如下：95°C变性5min，95°C退火30s，56°C30s,72°C30s,45循环，最终72°C延

5、伸7min。将PCR产物10u1于1.2%琼脂糖凝胶电泳30min,采用凝胶自动成像及分析系统，电泳结果用凝胶图像分析系统分析电泳条带光密度值，计算光密度与GAPDH的光比值。1.3流式细胞术检测细胞周期和凋亡未经任何处理的肝癌细胞为空白组。转染FAT10siRNA(FATlOsiRNA组)和重组表达载体pcDNA3.1-FAT10(pcDNA3.1-FAT10组)48h后，收集各组细胞，37°C下，0.25%胰酶消化，1500r/min,离心lOmin，去上清，PBS洗涤3次，重悬细胞浓度为lX106/ml。移液枪取100ul的细胞于流式管中，缓慢

6、加入70%的乙醇溶液，同时用移液枪移取100P1的细胞于另一组流式管中，缓慢加AnnexinV-FITC溶液，两组流式管4°C下充分振荡，并静置24h，1000r/min离心10min后，除去细胞固定液，PBS溶液洗涤多次，加入100ul,200ug/ml的RNA酶溶液，室温静置lh，加入50ug/ml的Pr液染色，0.5h后流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。1.4RT-PCR检测PI3K/Akt信号通路按TRIzolReagent说明书提取各组细胞总RNA，以总RNAmRNA为模板，反转录合成cDNA，在扩增仪上进行RT-PCR。正反向引物各加入1ul

7、悬浮细胞液FAT10的上游为：5'-AATACCTGGTGTCGGTCTCA-3z,下游为：5'-TCGAGCTCATCCTAATGGAG-3'，扩增目的基因片段长度为210bp。内参GAPDH的上游为：5'-TCCCATCACCATCTTCCAG-3'，下游为：5'-AGGAGTGGGTGTCGCTG-3'，目的基因扩增长度为350bp。反应条件：95°C变性5min，95°C退火30s,61.5°C30s,72°C30s,30循环，72°C延伸lOmin。将PCR产物10P1于1.2%琼脂糖凝胶电泳30min,结果用凝胶图像分析系统分析，计算光密

8、度与GAPDH的光比值。1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，计量数据以平均数土标准差