双泛素蛋白fat10在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制的初步探讨

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1、硕士学位论文双泛素蛋白FATl0在肝细胞癌发生发展中的作用及其机制的初步探讨硕士研究生：董忠谊JIm／IIInlJFIJllIIIIlllJIJJ指导教师：吴德华Y2525273摘要研究背景和目的原发性肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是临床上最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率逐年增长，已超过62．6万／年，居于恶性肿瘤的第5位，死亡接近60万／年，位居肿瘤相关死亡的第3位。肝癌在我国高发，目前，我国发病人数约占全球的55％，在肿瘤相关死亡中位居第2位。因此，肝癌严重威胁我国人民健康和生命。肝癌治疗目前仍然以外科手术切除或肝移植为最佳选择，但大多数患者确诊时已是中晚

2、期，而丧失手术机会，及肝癌对常见化疗药物不敏感，因此，目前没有有效的化疗方案用于肝癌的治疗。值得庆幸的是，分子靶向药物索拉菲尼是有史以来第一个能够使肝癌患者生存期延长的药物，给肝癌的治疗带来了新的希望。因此，有必要加强肝癌的基础研究，阐明其发病机制，发现和鉴定出高度特异性和敏感性的肿瘤分子标志物，用于肝癌的预后判断及研发新的分子靶向药物，进而提高肝癌患者的生存率和降低死亡率。FATIO也称为双泛素，是一种由165个氨基酸组成的18KD的蛋白，在成熟B细胞和树突状细胞中表达，它属于泛素样调节子(UBL)蛋白家族，由两个泛素样部分前后融合而成。UBL蛋白家族通过与其他蛋白质共价结合而行使泛素样修

3、饰作用。最近的研究表明UBL蛋白家族参与多种生物学过程，包括细胞分裂、DNA修复、自噬、信号转导及胚胎发育等。因此，UBL蛋白家族在许多人摘要类疾病(尤其是肿瘤)的发生及发展中扮演了重要角色。研究发现FATl0在多种肿瘤中高表达，如肝癌、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌等，与肿瘤的发生、发展、转移密切相关。而其中FATl0与肝癌的关系最为密切。在肝癌发生研究中，经过如药物DDC(3，5-diethoxcarbonyl．1,4一dihydroeollidine)、灰黄霉素、狄氏剂等处理后的小鼠肝脏细胞中会出现MalloryDenkBodies(MDBs)，随后观察到这些小鼠肝脏发生了肿瘤，提示MDBs

4、的形成是一种癌前病变。对这些用药物预处理后的小鼠肝脏进行基因表达谱分析，结果发现许多癌基因的表达上调，而其中表达上调最高的则是FATl0基因。进一步研究发现，FATlO表达阳性的肝细胞在停药后4个月中仍然持续过表达，停药8个月后在FATl0过表达的部分肝脏组织中发生了肿瘤，提示FATl0与肝癌的发生密切相关。然而，到目前为止很少有研究探讨FATl0在肝癌发生发展中的作用及其参与肝癌形成的具体机制。本文通过从基因和蛋白水平研究肝癌组织及癌旁组织中FATl0表达情况进而分析其对肝癌患者预后及术后复发的影响。进一步通过基因过表达及干扰手段探讨FATl0对肝癌细胞增殖、侵袭及上皮一问充质转化(EMT

5、)等生物学过程的影响及其相关机制，阐明了FATIO在肝癌发生、发展中的作用，为判断肝癌预后及分子靶向治疗奠定了理论基础。方法1、FATl0在肝癌及癌旁组织中表达情况及临床意义利用Real．TimePCR方法检测30对肝癌组织及癌旁组织中FATl0mRNA的表达水平，同时利用weStemblot方法检测8对肝癌．癌旁配对组织中FATl0蛋白表达水平。进一步通过免疫组化方法检测FATl0在212例肝癌患者石蜡切片中的表达情况。为了证实上述实验结果，我们通过组织芯片技术进一步扩大样本量，检测278例肝癌、30例正常肝及50例肝炎肝硬化组织中FATl0表达水平。采用Mann-WhitneyU一检验方

6、法分析212例肝癌患者肿瘤切片中FATl0表达水平与相应临床病理参数的相关性。Kaplan-Meier法分析FATl0表达对患者总II硕士学位论文体生存率的影响。COX比例风险回归模型进行单因素及多因素分析影响肝癌患者总体生存率的危险因素。2、FATIO在肝癌细胞中的生物学作用用FuGENE⑩HD转染试剂介导pReceiver-M29．FATl0质粒转染HepG2及SMMC．7721肝癌细胞株，G418筛选阳性克隆；用阳离子脂质体LipofectamineTMRNAiMAX介导FATl0．siRNA转染Huh7及LM3肝癌细胞株，采用westernblot方法鉴定转染后FATIO蛋白在细胞中

7、的表达，然后利用MTT法测定转染前后细胞增殖能力的变化，BrdU掺入试验检测转染前后增殖期细胞数目变化，采用流式细胞仪检测转染前后细胞周期变化，westemblot方法检测转染前后增殖及周期相关蛋白表达改变。进一步通过裸鼠皮下成瘤试验从体内验证FATl0过表达对肿瘤增殖活性的影响，利用免疫组化法检测FATl0过表达组与对照组裸鼠皮下瘤中增殖及周期相关蛋白表达情况。利用共聚焦显微镜观察肝癌细胞HepG2稳定表达