一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备

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1、一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备：李华，汪根树，张剑，姜楠，贾昌昌，杨扬，陈规划【摘要】【目的】制备出一种人硫氧还蛋白(hTrx)基因修饰的肝细胞。【方法】逆转录聚合酶链反应法扩增出hTrxcDNA，应用重组逆转录病毒制备hTrx基因修饰大鼠肝细胞。白蛋白免疫组化SABC法进行肝细胞活性鉴定，MTT比色试验进行抗氧化应激能力检测。【结果】克隆出hTrx开放阅读框cDNA并制备出重组逆转录病毒，感染真核细胞后可分泌融合表达的hTrx并具有生物学活性。制备出hTrx基因修饰大鼠肝细胞，免疫组化SABC法显示肝细胞功能正常，MTT比色法检测具有较强的抗氧化应激能力(P<0.05)，

2、并可有效增殖。【结论】成功制备出一种具有较强抗氧化应激的hTrx基因修饰肝细胞。【关键词】肝细胞;人硫氧还蛋白;基因修饰　Abstract：【Objective】Topreparethehumanthioredoxin(hTrx)gene-modifiedhepatocytes.【Methods】hTrxcDNAplifiedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)，rebinantretrovirusaryculturedrathepatocyteforinfectiontogeneratehTrxgene-modi

3、fiedrathepatocytes，inedin-immunohistochemicalstainingandMTTassay，respectively.【Results】ThehTrxopenreadingframescDNAbledoffusionproteins.ImmunohistochemistrydemonstratednormalfunctionofthehTrxgene-modifiedhepatocytes，odifiedhepatocyteorestrongerantioxidativecapacityisprepared.　　人硫氧还蛋白(humanthiore

4、doxin，hTrx)是目前已知Trx中活性最好的蛋白，由TrX构成的氧化还原系统广泛存在于组织细胞中，具有清除自由基和维持体内稳定的氧化还原状态的重要作用，对缺血再灌注损伤有明确的保护作用。Trx也可通过对转录因子如NF-κB等的调节作用，促进细胞的增殖及抑制细胞的凋亡等[1-2]。研究发现Trx对肝细胞生存生长具有明显的促进作用[3]，同时其抗氧化和凋亡抑制作用，因此可在肝细胞移植和生物人工肝细胞保存方面发挥重要作用。但能否持久地促进肝细胞的增殖，减少凋亡和氧化应激成为Trx应用的关键。本实验成功进行了hTrx基因修饰肝细胞的制备，修饰后的肝细胞表现出较强的抗氧化应激能力，可缓解细

5、胞损伤等。　　1材料和方法　　1.1hTrxcDNA基因克隆　　根据GenBank中hTrxcDNA序列(J04026)设计引物，引入BglⅡ、BamHⅠ酶切位点，并加入对框序列TT(不含终止子TAA)。引物：正向5′-GCAGATCTATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3′，反向5′-GCGGATCCTTGACTAATTCATTAATGGTGGCTTC-3′。异硫氰酸胍一步法从143(TK-)人骨肉瘤细胞中提取模板RNA。应用锚定引物oligo(dT)15逆转录合成cDNA第一条链，聚合酶链反应(PCR)扩增hTrxcDNA基因，插入载体质粒pGEM-TEasy构建重组质粒pG

6、EM/hTrx，并进行基因序列测定。质粒的制备、纯化、酶切、连接及转化按常规方法进行。　　1.2含hTrx基因的重组逆转录病毒载体的构建　　大量制备逆转录病毒载体pLEGFP-N1(购自Clontech公司)，将其和pGEM/hTrx分别行BglⅡ、BamHⅠ联合酶切、回收、连接。筛选鉴定含hTrx基因的重组质粒pLEGFP/hTrx。　　1.3重组逆转录病毒的制备　　运用磷酸钙共沉淀转染法进行重组逆转录病毒的制备。取pLEGFP/hTrx，电泳定量约1g/L。加入2.5mol/LCaCl2，加至复苏的PA317细胞(胚胎成纤维细胞)表面，可见细密沉淀钙粒形成。37℃下CO2培养箱内培

7、养8h，加入含100mL/L小牛血清的DMEM培养液，置37℃培养箱内72h。2.5g/L胰酶消化后按1：3传代，质量浓度为400μg/mL的G418(一种氨基糖苷类抗生素)筛选高表达细胞株。14d时有多个抗性克隆形成，细胞克隆单瓶培养至抗性细胞形成单层，消化传代后，加入DMEM培养液(不含G418)培养;收集细胞上清液进行病毒浓缩纯化。加入预冷饱和硫酸铵，透析纯化浓缩，经0.22μm微孔滤膜除菌处理。　　1.4重组逆转录病毒滴度测定　　复苏N