白细胞介素-10基因修饰对大鼠肝细胞系brl生长的影响

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1、担蕉型堂塑2013OctoberJFujianMedUniv⋯.⋯vo147No5271白细胞介素一10基因修饰对大鼠肝细胞系BRL生长的影响陈运新,黄月红,张莉娟,陈治新,王小众摘要:目的观察白细胞介素一10(IL一1O)基因修饰对大鼠肝细胞增殖、凋亡的影响,并筛选出表达可能受影响的细胞因子。方法体外培养大鼠肝细胞系BRL,分为对照组(C组),转染pcDNA3.0空质粒(P组),转染pcDNA3.0-rIL一10重组质粒(I组)。MTT法检测其增殖,流式细胞法检测其凋亡,抗体芯片法检测其细胞因子的表达。结果转染48h后

2、,P组较C组增殖减少(P一0.ooo),凋亡增加(P—o.ooo);I组较P组增殖差别无统计学意义(P=o.279),但凋亡明显减少(P一0.000)。抗体芯片显示I组较P组除IL一1O表达增加之外,血管表皮生长因子(VEGF)的表达下调。结论IL一1O基因治疗肝纤维化中,将肝细胞做为IL一1O基因的表达细胞具有可行性。IL一1O基因修饰后,肝细胞除了高表达IL一1O之外,还通过下调VEGF的表达间接作用。关键词:白细胞介素10;肝细胞;基因;基因表达;基因疗法;细胞因子类;血管内皮生长因子类中图分类号:R332;R32

3、9.24;R392.11;R394.2;R575文献标识码:A文章编号:1672-4194(2O13)O5一O271一O3肝纤维化是各种慢性肝病后期发展为肝硬化(美国Backman公司);大鼠19种细胞因子抗体芯的共同病理过程。白细胞介素一10(interleukin一10,片试剂盒(美国Ray—Biotech公司)。IL一10)是目前被认为很有希望的抗肝纤维化因子。1.2方法多项针对患者和动物的研究都证实外源性IL一1O可1.2.1rlL一10基因转染对BRL细胞增殖的影响以抑制甚至逆转肝纤维化的发展l_1]。但IL一

4、1O半BRL细胞以每孔5×10。细胞接种于96孔板中,每衰期短(仅2h),静脉用药缺乏靶向性,而基因治疗列的第1孔不加细胞,为空白对照孔,于37℃、体积有可能解决这些问题。笔者进行了相应的前期研分数为0.05的CO。培养箱内培养。待细胞贴壁伸究:利用受体介导的脂质体将重组IL一10质粒转染展达底面积5O~6O%时,吸弃上清更换新培养大鼠肝细胞系BRL,获得高转染率及分泌型IL一10基,随机分为3组,每组8孔:BRL细胞对照组的表达l3;发现转染IL一10基因的BRL细胞可以明(C组),pcDNA3.0-rIL-10重组质

5、粒转染组(I组)显抑制与之共培养的原代肝星状细胞的增殖和活和pcDNA3空质粒转染组(P组)。按jetPEI—gal转化l_4]。动物实验也证实,IL一1O基因治疗能明显抑染试剂操作说明将pcDNA3.0-rIL一10重组质粒和制猪血清诱导的大鼠肝纤维化]。为进一步了解肝pcDNA3空质粒转染进BRL细胞,每孔0.3tzg质细胞是否适合做为IL一1O基因的表达细胞,本研究粒;转染后24h,弃原培养液,更换新培养基,置于观察IL一1O基因修饰对其增殖、凋亡的影响,并筛选37℃、体积分数为0.05的CO。培养箱内培养出表达可

6、能受影响的细胞因子。24,48h;每孔加入MTT溶液2OL,37℃孵育4h后弃孔内培养液,每孔加入15OLDMSO溶液振1材料与方法荡10rain,以空白孔调零,在酶联免疫检测仪上测1.1材料永生化的正常大鼠肝细胞系BRL引自490nm波长处的每孔吸光度值(A值)。采用方差中科院上海细胞库。真核表达载体pcDNA3.0(美分析法比较各组间差异。国Invitrogen公司);真核表达载体pcDNA3.0-rIL一1.2.2rIL一10基因转染对BRL细胞凋亡的影响10由本实验室构建[3;vitro—jetPEI—gal转染

7、试剂盒将BRL细胞用含109/6胎牛血清的DMEM培养液(美国polyplustransfection公司);Annexin稀释成1×1OmL接种于6孔培养板,待细胞贴V—FITC试剂盒(奥地利Bender公司);流式细胞仪壁伸展达底面积50~6O时,吸弃上清,而后随机分为3组,分组与转染方法同上,每孔3g质粒。48h后分别将各组细胞消化离心,用PBS洗涤细收稿日期:2013—09一O3基金项目:2012福建省临床医学重点专科基金;福建省自然基金胞;用预先稀释的结合缓冲液(结合缓冲液:双蒸水(青年)(2010J05062

8、,2OLOJ01165);福建省卫生厅青年基金(2010—1—10)一1:3)重悬细胞,调整细胞密度为2×10~5×10作者单位:1.福建医科大学附属协和医院消化内科,福州mL一;取195L的细胞悬液加人5LAnnexin350001;2.福建省消化研究所,福州350001作者简介:陈运新(1975),男,副主任医师

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1、担蕉型堂塑2013OctoberJFujianMedUniv⋯.⋯vo147No5271白细胞介素一10基因修饰对大鼠肝细胞系BRL生长的影响陈运新,黄月红,张莉娟,陈治新,王小众摘要:目的观察白细胞介素一10(IL一1O)基因修饰对大鼠肝细胞增殖、凋亡的影响,并筛选出表达可能受影响的细胞因子。方法体外培养大鼠肝细胞系BRL,分为对照组(C组),转染pcDNA3.0空质粒(P组),转染pcDNA3.0-rIL一10重组质粒(I组)。MTT法检测其增殖,流式细胞法检测其凋亡,抗体芯片法检测其细胞因子的表达。结果转染48h后

2、,P组较C组增殖减少(P一0.ooo),凋亡增加(P—o.ooo);I组较P组增殖差别无统计学意义(P=o.279),但凋亡明显减少(P一0.000)。抗体芯片显示I组较P组除IL一1O表达增加之外,血管表皮生长因子(VEGF)的表达下调。结论IL一1O基因治疗肝纤维化中,将肝细胞做为IL一1O基因的表达细胞具有可行性。IL一1O基因修饰后,肝细胞除了高表达IL一1O之外,还通过下调VEGF的表达间接作用。关键词:白细胞介素10;肝细胞;基因;基因表达;基因疗法;细胞因子类;血管内皮生长因子类中图分类号:R332;R32

3、9.24;R392.11;R394.2;R575文献标识码:A文章编号:1672-4194(2O13)O5一O271一O3肝纤维化是各种慢性肝病后期发展为肝硬化(美国Backman公司);大鼠19种细胞因子抗体芯的共同病理过程。白细胞介素一10(interleukin一10,片试剂盒(美国Ray—Biotech公司)。IL一10)是目前被认为很有希望的抗肝纤维化因子。1.2方法多项针对患者和动物的研究都证实外源性IL一1O可1.2.1rlL一10基因转染对BRL细胞增殖的影响以抑制甚至逆转肝纤维化的发展l_1]。但IL一

4、1O半BRL细胞以每孔5×10。细胞接种于96孔板中,每衰期短(仅2h),静脉用药缺乏靶向性,而基因治疗列的第1孔不加细胞,为空白对照孔,于37℃、体积有可能解决这些问题。笔者进行了相应的前期研分数为0.05的CO。培养箱内培养。待细胞贴壁伸究:利用受体介导的脂质体将重组IL一10质粒转染展达底面积5O~6O%时,吸弃上清更换新培养大鼠肝细胞系BRL,获得高转染率及分泌型IL一10基,随机分为3组,每组8孔:BRL细胞对照组的表达l3;发现转染IL一10基因的BRL细胞可以明(C组),pcDNA3.0-rIL-10重组质

5、粒转染组(I组)显抑制与之共培养的原代肝星状细胞的增殖和活和pcDNA3空质粒转染组(P组)。按jetPEI—gal转化l_4]。动物实验也证实,IL一1O基因治疗能明显抑染试剂操作说明将pcDNA3.0-rIL一10重组质粒和制猪血清诱导的大鼠肝纤维化]。为进一步了解肝pcDNA3空质粒转染进BRL细胞,每孔0.3tzg质细胞是否适合做为IL一1O基因的表达细胞,本研究粒;转染后24h,弃原培养液,更换新培养基,置于观察IL一1O基因修饰对其增殖、凋亡的影响,并筛选37℃、体积分数为0.05的CO。培养箱内培养出表达可

6、能受影响的细胞因子。24,48h;每孔加入MTT溶液2OL,37℃孵育4h后弃孔内培养液,每孔加入15OLDMSO溶液振1材料与方法荡10rain,以空白孔调零,在酶联免疫检测仪上测1.1材料永生化的正常大鼠肝细胞系BRL引自490nm波长处的每孔吸光度值(A值)。采用方差中科院上海细胞库。真核表达载体pcDNA3.0(美分析法比较各组间差异。国Invitrogen公司);真核表达载体pcDNA3.0-rIL一1.2.2rIL一10基因转染对BRL细胞凋亡的影响10由本实验室构建[3;vitro—jetPEI—gal转染

7、试剂盒将BRL细胞用含109/6胎牛血清的DMEM培养液(美国polyplustransfection公司);Annexin稀释成1×1OmL接种于6孔培养板,待细胞贴V—FITC试剂盒(奥地利Bender公司);流式细胞仪壁伸展达底面积50~6O时,吸弃上清,而后随机分为3组,分组与转染方法同上,每孔3g质粒。48h后分别将各组细胞消化离心,用PBS洗涤细收稿日期:2013—09一O3基金项目:2012福建省临床医学重点专科基金;福建省自然基金胞;用预先稀释的结合缓冲液(结合缓冲液:双蒸水(青年)(2010J05062

8、,2OLOJ01165);福建省卫生厅青年基金(2010—1—10)一1:3)重悬细胞,调整细胞密度为2×10~5×10作者单位:1.福建医科大学附属协和医院消化内科,福州mL一;取195L的细胞悬液加人5LAnnexin350001;2.福建省消化研究所,福州350001作者简介:陈运新(1975),男,副主任医师

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