一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备

《一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备作者：李华，汪根树，张剑，姜楠，贾昌昌，杨扬，陈规划【摘要】【目的】制备出一种人硫氧还蛋白(hTrx)基因修饰的肝细胞。【方法】逆转录聚合酶链反应法扩增出hTrxcDNA，应用重组逆转录病毒制备hTrx基因修饰大鼠肝细胞。白蛋白免疫组化SABC法进行肝细胞活性鉴定，MTT比色试验进行抗氧化应激能力检测。【结果】克隆出hTrx开放阅读框cDNA并制备出重组逆转录病毒，感染真核细胞后可分泌融合表达的hTrx并具有生物学活性。制备出hTrx基因修饰大鼠肝细胞，免疫组化SABC法显示肝细胞功能正常，MTT比色法检测具有较强的抗氧化应激能力(P<0.05)，并

2、可有效增殖。【结论】成功制备出一种具有较强抗氧化应激的hTrx基因修饰肝细胞。【关键词】肝细胞;人硫氧还蛋白;基因修饰　Abstract：【Objective】Topreparethehumanthioredoxin(hTrx)gene-modifiedhepatocytes.【Methods】hTrxcDNAwasamplifiedbyreversetranscription-polymerasechainreaction(RT-PCR)，recombinantretroviruswasappliedtoprimaryculturedrathepatocyteforinfectiontog

3、eneratehTrxgene-modifiedrathepatocytes，whoseviabilityand13antioxidativecapacitywereexaminedwithalbumin-immunohistochemicalstainingandMTTassay，respectively.【Results】ThehTrxopenreadingframescDNAwasclonedandassembledwithrecombinantretrovirus，theneukaryoticcellsinfectedbythisviruswerecapableofexpressin

4、gbioactivehTrxintheformoffusionproteins.ImmunohistochemistrydemonstratednormalfunctionofthehTrxgene-modifiedhepatocytes，whichpossessedstrongantioxidativecapacityasshownbyMTTassayandcouldbeproliferatedeffectively.【Conclusion】ThehTrxgene-modifiedhepatocytewithmorestrongerantioxidativecapacityisprepar

5、ed.　　人硫氧还蛋白(humanthioredoxin，hTrx)是目前已知Trx中活性最好的蛋白，由TrX构成的氧化还原系统广泛存在于组织细胞中，具有清除自由基和维持体内稳定的氧化还原状态的重要作用，对缺血再灌注损伤有明确的保护作用。Trx也可通过对转录因子如NF-κ13B等的调节作用，促进细胞的增殖及抑制细胞的凋亡等[1-2]。研究发现Trx对肝细胞生存生长具有明显的促进作用[3]，同时其抗氧化和凋亡抑制作用，因此可在肝细胞移植和生物人工肝细胞保存方面发挥重要作用。但能否持久地促进肝细胞的增殖，减少凋亡和氧化应激成为Trx应用的关键。本实验成功进行了hTrx基因修饰肝细胞的制备，修饰后

6、的肝细胞表现出较强的抗氧化应激能力，可缓解细胞损伤等。　　1材料和方法　　1.1hTrxcDNA基因克隆　　根据GenBank中hTrxcDNA序列(J04026)设计引物，引入BglⅡ、BamHⅠ酶切位点，并加入对框序列TT(不含终止子TAA)。引物：正向5′-GCAGATCTATGGTGAAGCAGATCGAGAG-3′，反向5′-GCGGATCCTTGACTAATTCATTAATGGTGGCTTC-3′。异硫氰酸胍一步法从143(TK-)人骨肉瘤细胞中提取模板RNA。应用锚定引物oligo(dT)15逆转录合成cDNA第一条链，聚合酶链反应(PCR)扩增hTrxcDNA基因，插入载体质

7、粒pGEM-TEasy构建重组质粒pGEM/hTrx，并进行基因序列测定。质粒的制备、纯化、酶切、连接及转化按常规方法进行。　　1.2含hTrx基因的重组逆转录病毒载体的构建　　大量制备逆转录病毒载体pLEGFP-N1(购自Clontech公司)，将其和pGEM/hTrx分别行BglⅡ、BamHⅠ联合酶切、回收、连接。筛选鉴定含hTrx基因的重组质粒pLEGFP/hTrx。　　1.3重组逆转录病毒的制备13