锌指蛋白265在大鼠睾丸sertoli细胞中的特异性表达

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1、锌指蛋白265在大鼠睾丸Sertoli细胞中的特异性表达：席晔斌,李荣平,王保国,葛瑜,沈天伟,蒋黎华,李伟毅【摘要】目的:研究锌指蛋白265(ZNF265）在大鼠睾丸Sertoli细胞中的特异性表达。方法:分离培养SD大鼠睾丸Sertoli细胞,以免疫荧光染色、流式细胞术（FCM）检测ZNF265在Sertoli细胞的表达,且抽提Sertoli细胞总RNA,用PTPCR法检测ZNF265的表达。结果:经免疫荧光染色,实验组Sertoli细胞核核周呈现明亮特异荧光,对照组未见特异性荧光;FCM检测结果显示实验组Sertoli细胞ZNF265的表达

2、较对照组明显增高;RTPCR扩增出目的条带ZNF265。结论:大鼠睾丸Sertoli细胞特异性表达ZNF265,且多表达于Sertoli细胞核核周胞质。【关键词】ZNF265;Sertoli细胞;SD大鼠;ZNF265表达锌指蛋白265（Zincfingerprotein265,ZNF265）由Karginova等［1］首先于大鼠肾球旁细胞中克隆。研究发现,ZNF265在生物体中有广泛的表达,尤其在人类和小鼠生殖系统的表达具有特异性。目前研究认为ZNF265具有RNA结合能力［2］,是一个参与细胞分化、发育、基因表达调控的多功能蛋白,与个体发育,

3、疾病密切相关。Sertoli细胞（支持细胞）是睾丸主要的基质细胞,参与血睾屏障的组成和分泌细胞因子。我们以往的研究发现,Sertoli细胞在局部抗感染中发挥着重要的免疫调节作用,并参与、维持大鼠睾丸的免疫豁免［3,4］。本研究旨在探讨ZNF265在大鼠睾丸Sertoli细胞中的表达,为进一步探讨ZNF265的表达与Sertoli细胞的免疫功能的关系奠定基础。1材料和方法1.1材料SD大鼠（雄性,15天龄,35g）,购自上海交通大学医学院动科部。胶原酶II型、透明质酸酶均购自EM/F12培养液购自Sigma公司。TritonX100购自Qbiog

4、ene公司。兔抗大鼠ZNF265抗体由复旦大学生命科学院生理学及生物物理系徐平教授惠赠。FITC标记的山羊抗兔IgG抗体购自KPL公司。奥林巴斯IX70倒置荧光显微镜购自Olympus公司。固定/穿透工作液购自eBioscience公司。流式细胞仪（FACSCalibur）购自BD公司。TRIzol购自Invitrogen公司。SuperscriptII（K1622）试剂盒、2×PCRMasterMix试剂盒（K0171）均购自Fermentas公司。1.2.1Sertoli细胞的分离培养SD大鼠断颈处死,无菌状态分离取得睾丸组织,经胶原酶II型

5、、透明质酸酶消化、过滤、离心获得高纯度、高活率的Sertoli细胞［5］。在含100mL/L小牛血清的DMEM/F12培养液中于37℃、50mL/LCO2条件下培养。1.2.2免疫荧光染色将分离得到的Sertoli细胞接种于6孔培养板中（培养板内预置圆形玻片）培养,待玻片细胞贴壁率为80％时,用预温pH7.4的0.01mol/LPBS洗涤,甲醇固定10min（甲醇于-18℃预冷）,PBS洗涤,用0.02mL/LTritonX100透化破膜2～5min,PBS洗涤,然后加入0.5mL/L正常山羊血清,室温封闭20min,PBS洗涤,加入兔抗大鼠Z

6、NF265抗体100μL,置于湿盒内4℃过夜。次日PBS洗涤后,加入50μLFITC标记的山羊抗兔IgG抗体,室温避光30min,PBS洗涤3次,双蒸水洗涤3次,最后950mL/L甘油封片,于倒置荧光显微镜下镜检。1.2.3流式细胞术（FCM）分析分离得到的Sertoli细胞按5×109/L密度接种于培养瓶内,次日弃去培养瓶中的液体,用胰酶消化贴壁细胞,按5×105/管,加入流式管中。然后用冷PBS（含1000mg/LBSA）洗涤,1800r/min,离心10min,尔后加入1mL固定/穿透工作液,4℃作用1h,同上洗涤,再加入20μL兔抗大鼠Z

7、NF265抗体37℃孵育1h,同上洗涤。然后加入20μLFITC标记的山羊抗兔IgG抗体,室温避光15～20min,PBS洗涤3次,最后加入500μLPBS,流式细胞仪测定。1.2.4Sertoli细胞总RNA抽提按TRIzol试剂盒中的说明操作。1.2.5逆转录反应按SuperscriptII试剂盒中的说明操作。1.2.6PCR反应引物的设计:（1）ZNF265引物:按大鼠ZNF265DNA全长序列,取自GenBank,序列号GI:13928843。5′端引物:5′caaggtcttcatcacgctca3′,3′端引物:5′cacggg

8、atctggaatgttct3′。目的基因产物的长度126bp。（2）βactin:按大鼠βactinDNA全长序列