trpv4在大鼠睾丸组织中的表达

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1、硕士学位论文研究背景TI冲V4在大鼠睾丸组织中的表达硕士研究生：高炜城导师：王行环摘要在细胞内环境中，钙离子是触发细胞增殖的关键信息分子和必经途径，而细胞浆内钙离子浓度受细胞膜钙离子通道的调控。最新有关细胞膜钙离子通道的研究提示：细胞膜钙离子通道被激活引起的钙内流是触发细胞增殖的必经途径；非电压依赖性钙通道瞬时受体电位(TransientReceptorPotential，TRP)具有调节细胞存活／生长／死亡等功能．在TRP介导的众多功能和疾病中，它在细胞增殖中的作用尤为突出，这在许多组织和细胞，已经有实验结果的支持。例如，肺动脉平滑肌细胞的TRPCI和TRPC6表达显著增高，

2、它们的所介导的钙内流刺激平滑肌细胞的增殖，最终导致肺动脉高压的发生；血管内皮来源的生长因子(VEGF)通过激活内皮细胞的TRP通道，引起钙内流，刺激血管内皮细胞增生，可导致肿瘤新生血管的生成；TRPMl的表达与黑色素瘤的恶性程度密切相关；这些结果均表明，TRP在调节细胞的增殖中具有不容忽视的作用。目前不少研究已经发现，TRP基因家族的多个亚型在睾丸上有表达，部分还是高表达。然而，关于这方面的研究还是很少，因此有必要对此进行研究。上述在睾丸附睾上的研究都是仅限于是否表达的问题，既然TRP家族在睾丸上的表达如此丰富，其在睾丸上有何功能就变成了现在应该关心的，而目前国际上的研究尚没有

3、相关的研究报道。中文摘要目前国际上的研究表明：TRPV4大量表达于肾远曲小管的上皮组织，也少量表达于心、肝、肺、脾、睾丸及许多其他组织。尽管功能方面的研究已经取得了不少成果，如：TRPV4在气管平滑肌细胞的表达可能涉及到气道的高反应性，如哮喘；TRPV4在柯蒂氏器的表达可能提示感觉神经性的听力损害；TRPV4与母羊的温度改变引起的排尿反射有关。但是TRPV4在睾丸上的功能至今未有报导。研究其与睾丸的关系将具有重要的现实意义和广阔的发展前景。因此，研究TRPV4与睾丸上的分布以及功能是具有很大意义的。为此，我们通过动物实验对TRPV4通道与睾丸组织的关系进行初步研究。目的研究TR

4、P基因亚家族成员TRPV4在大鼠睾丸组织中的表达。探讨TRP基因家族在睾丸上的表达，为睾丸组织上TRPV4功能的研究奠定基础。方法第一部分常规RT-PCR检测TRPV4在大鼠睾丸组织中mRNA的表达1．TRPV4基因引物的设计登陆TRPV4大鼠的genebank，采用PrimerPremer5．0软件自行设计引物。2．总RNA提取及cDNA的合成氯仿吸入处理大鼠，处理后大鼠处于昏迷状态，采集睾丸组织，立即投到液氮中保存。取100m睾丸组织，按照分子克隆常用方法Trizol法提取细胞总IⅢA；然后用DNaseI在37。C消化30min，以除去可能存在的DNA污染。核酸／蛋白质定量

5、分光光度计测定其A260及A280。对于A260／A280大于18而小于20的RNA样本，取lug总RNA，按照试剂说明书合成cDNA。3．Rr-PCR以第一链为模板，按以下条件扩增：94。C10min，94。C45s，55℃45s，72℃lmin，30cycles，94。C1min，60。Clmin，72。C10min。扩增产物行O．7％琼脂糖TI硕士学位论文电泳。凝胶成像分析仪分析。第二部分免疫组织化学染色检测TRPV4蛋白在大鼠睾丸组织中的表达1．购买TRPV4单克隆抗体和SABC免疫组化试剂盒TRPV4的单克隆抗体。2．标本获取及处理：氯仿吸入处理大鼠，处理后大鼠处于昏

6、迷状态，采集睾丸组织，投入福尔马林溶液中固定，经阶梯脱水、二甲苯透明及浸蜡后，石蜡包埋组织。3．免疫组织化学染色采用SABC方法，所有组织标本以厚度49m连续切片3张，按照试剂说明书操作，采用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。以胞浆呈棕黄色颗粒为阳性表达。第三部分Westernblot检测TRPV4蛋白在大鼠睾丸组织中的表达1．标本获取及处理氯仿吸入处理大鼠，处理后大鼠处于昏迷状态，采集睾丸组织，用蛋白提取液提取蛋白，用预冷的PBS洗2次，去上清，加4xSDS凝胶上样缓冲液，沸水浴变性10min。2．Westernblot常规制备SDS．PAGE凝胶，点两组相同样品，1

7、20V电泳约3．5h后，切下其中一组按常规方法固定、考马斯亮蓝R-250染色和脱色，作为判断Westernblot的依据。另一组样品切胶转膜，硝酸纤维素膜按凝胶大小剪裁，并头尾做好标记，两侧各置滤纸3张，按胶负膜正放置，4。C、18V转膜过夜。取出膜，用封闭液封闭至少2h，TBS液洗膜3次，每次10min；加入1：100稀释的一抗，4。C作用2h；TBS液洗膜3次，每次10mira加入1：5000稀释的羊抗兔IgG二抗，室温作用lh；TBS液洗膜3次，每次10min；用反射显影技术观察条带。