一种高效扩增人t细胞受体β链可变区基因的方法建立

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1、一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立：叶海燕,王琳,范振平钟彦伟苏何玲刘永明,徐东平【摘要】目的:建立一种高效扩增人T细胞受体（TCR）β链可变区（Vβ）基因的方法。方法:根据TCRVβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条,并将内、外上游引物各分为8个简并组。在恒定区（C区）设计下游内、外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人CD8T细胞TCRVβ26个亚家族基因,并用JurkatT淋巴瘤细胞作为对照。用Teasy载体克隆RTPCR产物,对克隆基因进

2、行测序。结果:从正常人的CD8T细胞中扩增到所有TCRVβ亚家族基因,克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCRVβ8基因,经测序验证与文献报道一致,且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论:建立的巢式RTPCR方法可以高效、广谱地扩增人TCRVβ基因,为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。【关键词】CD8T细胞;T细胞受体（TCR）;反转录PCR;基因克隆［Abstract］AIM:TodevelopaneffectiveassayforamplifyinghumanTcellreceptor(TCR)v

3、ariableregionofβchain(Vβ)encodinggenes.METHODS:Basedonthepropertyofthe26subfamiliesofhumanTCRVβencodinggenesequence,34setsofouterand37setsofinnersenseprimersergroups,andasetofouterandinnerantisenseprimerslocatedinconservedregionβchain(Cβ)plificationoftheTCRVβencodinggenes.Inaddition,aseque

4、ncingprimerandasenseprimerforamplifyingCβencodinggenesediatedbypolyA,folloerasechainreaction(PCR)toamplifythe26subfamiliesofhumanTCRVβencodinggenes.JurkatTlymphomacellsployedtodetectDNAsequencingoftheclonedtargetgenes.RESULTS:AllthesubfamiliesoftheVβencodinggenesCD8Tcellsofahealthydonor,ex

5、ceptthesubfamilyofVβ8,Jurkatcells.TheresultsedbyDNAsequencingoftheclonedgenes.CONCLUSION:ThenestedRTPCRassaycaneffectivelyamplifyhumanTCRVβencodinggenes,phocytes.［Keyingen公司,提取细胞RNA的RNessymini盒、PCR产物回收和凝胶电泳产物回收试剂盒均购自德国Qiagen公司,反转录试剂盒和pGEMTeasy载体均购自美国Promega公司。1.2方法1.2.1PBMC分离和CD8T细胞分选按照常规方

6、法分离PBMC,CD8T细胞的MACS磁珠分选操作方法按说明书进行。分选后的CD8T细胞用荧光标记的抗CD3和抗CD8抗体染色、流式细胞术（FCM）检测CD8T细胞的纯度和数量,用RPMI1640液调整细胞密度至2×109/L备用。1.2.2引物根据文献资料［5,6］和从GenBank下载的257条人TCRVβ基因序列进行分析,根据Vβ各个亚家族的基因序列特点,在相对保守的信号肽区设计出相应的25个亚家族特异性上游引物(Vβ26亚家族基因为假基因,故不设计实验),因为有些TCRVβ亚家族内部还分为几个不同的分家族,故共设计了上游外引物34条和上游内引物37条;在Cβ区设计下游外引

7、物doin;94℃30s,59℃30s（每个循环递减1℃）,55℃30s,72℃1min,30个循环;72℃5min;68℃5min。第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板,将对应的8组简并上游内引物分别与doin;94℃30s,60℃1min,72℃1min,40个循环;72℃5min;68℃5min;Jurkat细胞RNA模板扩增基因片段长度为578bp。一些实验中,第2轮PCR反应使用单一上游引物分管反应,以确定各亚家族引物的扩增效率。同时扩增βactin和TCRCβ编