一种高效扩增人t细胞受体β链可变区基因的方法建立

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1、一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立作者：叶海燕,王琳,范振平钟彦伟苏何玲刘永明,徐东平【摘要】目的:建立一种高效扩增人T细胞受体（TCR）β链可变区（Vβ）基因的方法。方法:根据TCRVβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、上游外引物37条,并将内、外上游引物各分为8个简并组。在恒定区（C区）设计下游内、外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人CD8T细胞TCRVβ26个亚家族基因,并用JurkatT淋巴瘤细胞作为对照。用Teasy载体克隆RTPCR

2、产物,对克隆基因进行测序。结果:从正常人的CD8T细胞中扩增到所有TCRVβ亚家族基因,克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCRVβ8基因,经测序验证与文献报道一致,且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论:建立的巢式RTPCR方法可以高效、广谱地扩增人TCRVβ基因,为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。【关键词】CD8T细胞;T细胞受体（TCR）;反转录PCR;基因克隆11［Abstract］AIM:TodevelopaneffectiveassayforamplifyinghumanT

3、cellreceptor(TCR)variableregionofβchain(Vβ)encodinggenes.METHODS:Basedonthepropertyofthe26subfamiliesofhumanTCRVβencodinggenesequence,34setsofouterand37setsofinnersenseprimersweredividedinto8degenerateprimergroups,andasetofouterandinnerantisenseprimerslocatedinconservedregionβchain(C

4、β)wasdesignedfortheamplificationoftheTCRVβencodinggenes.Inaddition,asequencingprimerandasenseprimerforamplifyingCβencodinggenesweredesigned.CD8TcellRNAwasextractedandsubjectedtoreversetranscriptionmediatedbypolyA,followedbyanestedpolymerasechainreaction(PCR)toamplifythe26subfamilies

5、ofhumanTCRVβencodinggenes.JurkatTlymphomacellswereusedascontrol.TeasyvectorwasemployedtodetectDNAsequencingoftheclonedtargetgenes.RESULTS:AllthesubfamiliesoftheVβencodinggeneswereobtainedfromCD8Tcellsofahealthydonor,exceptthesubfamilyofVβ8,wasobtainedfromJurkatcells.Theresultswereco

6、nfirmedbyDNAsequencingoftheclonedgenes.CONCLUSION:ThenestedRTPCRassaycaneffectivelyamplifyhumanTCRVβencodinggeneswithbroadspectrum,whichishelpfulforthecloningandfunctionalstudyoftheTCRexpressedbyantigen11specificcytotoxicTlymphocytes.［Keywords］CD8Tcell;Tcellreceptor(TCR);RTPCR;gen

7、ecloningT细胞受体（Tcellreceptor,TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子,可分为TCRα/β和TCRγ/δ两种类型,外周血T细胞主要为TCRα/β的T细胞,是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。TCRβ基因由可变区（V）、多变区(D)、结合区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成。在T细胞发育过程中V区、D区和J区进行重排而形成具有功能的TCR编码基因,重排的过程中VD和DJ之间可有不同数量的核苷酸随机插入或删减的现象,这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性,以识别各种不同的抗原［1］。因此,分析TCRVβ