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《一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法的建立_陈晓》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第35卷第5期中国海洋大学学报35(5):807～8102005年9月PERIODICALOFOCEANUNIVERSITYOFCHINASept.,2005一种用磷酸钙法高效转染HEK293T细胞方法的建立1211陈晓,蒋捍东,路新枝,于文功(1.中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室,山东省海洋药物重点实验室,海洋药物与食品研究所,山东青岛266003;2.青岛大学医学部附属医院呼吸内科,山东青岛266003)摘要:利用磷酸钙转染法将lacZ-pShuttle质粒导入HEK293T细胞中,实验证明,pH值、DNA纯度、转染后培养时间和甘油休克时间是影响转染效率
2、的重要因素。转染后培养6h进行甘油休克效果最佳,比培养0h直接进行休克转染效率升高584.4%;甘油休克时间为4.5min时转染效果最佳,比不用甘油休克转染效率升高130.8%。通过对影响转染的几个条件进行优化,建立了1种可以高效转染HEK293T细胞的方法,且简便易行。关键词:磷酸钙转染;甘油休克;X-gal染色中图法分类号:Q813.4文献标识码:A文章编号:1672-5174(2005)05-807-05将DNA导入动物细胞中的方法很多,磷酸钙转染油;X-gal染液临用前加入终浓度为1mg/mL的X-gal法经济简单而且对细胞无毒性,是目前做真核细胞转(S
3、igma);0.5%戊二醛;玻璃奶(Pharmacia)。[1]染最常用的方法之一。磷酸钙转染法是Graham等1.2方法人于1973年建立的,利用细胞的内吞作用将磷酸钙-1.2.1lacZ-pShuttle质粒用磷酸钙转染法转染HEK[2-3]DNA复合物导入细胞内部,此后该法作为常规方293T细胞在60mm细胞培养皿中培养HEK293T法用于多种细胞的基因转染,可获得短暂或长期表达。细胞至密度为50%,转染前3h换液。在10mL离心但是随着该技术的广泛应用,人们发现在磷酸钙转染管中依次加入:ddH2O445μL,2.5mol/LCaCl250μL,法中,影响
4、转染成功与否及转染效率的高低的因素较lacZ-pShuttle质粒DNA5μL,充分混匀。用未加入质多,经常造成转染的低效率和不稳定性,国外探讨过一粒DNA的溶液作为阴性。在剧烈吹泡吹打下,逐滴加[4-6]系列影响磷酸钙转染的条件,但目前国内对磷酸钙入500μL2×HBSP溶液,室温静置30min。将细胞用转染条件进行系统研究的文献较少,本文基于此目的,无血清培养基洗2遍,迅速加入DNA-CaPi复合物盖住通过对磷酸钙转染条件的优化,确定了几个对转染效表面,37℃放置30min,加入1mL含10%FCS的率至关重要的因素,将lacZ-pShuttle质粒高效率地
5、导DMEM培养基。37℃5%CO2下培养适当时间后,弃入HEK293T细胞,比以往文献报道的转染效率提高上清,加入预热的含10%FCS的DMEM培养基5mL,35了约10～10倍。37℃5%CO[7]2下培养48h。用X-gal染色法检测β-半乳糖苷酶的表达,用1×PBS缓冲液冲洗2遍,室温下1材料和方法0.5%戊二醛固定细胞15min,1×PBS缓冲液冲洗31.1材料遍,用X-gal染液染色,37℃放置24h。洗去染液,光学1.1.1细胞株与质粒HEK293T细胞株由人肾上显微镜下观察蓝染细胞。皮细胞系293细胞派生,由本室提供。1.2.2优化磷酸钙转染条件p
6、Shuttle质粒购自CLONTECH,lacZ-pShuttle质1.2.2.1pH值和质粒纯度的影响HBSP缓冲液的粒由本室构建,将全长3.5kb的lacZ基因以XbaI和pH值分别调至6.70,6.96,7.10,转染HEK293T细NotI酶切位点插入MCS位点,位于Pcmv启动子下胞,37℃5%CO2下培养48h后X-gal染色,光学显微游。临转染前用玻璃奶纯化质粒DNA。镜下观察细胞;分别用纯化和未纯化的lacZ-pShuttle1.1.2试剂2×HBSP缓冲液,精确调节pH值;高质粒转染HEK293T细胞,37℃5%CO2下培养48h后糖DMEM培
7、养基(GbicolBRL);新生小牛血清(FCS,X-gal染色,光学显微镜下观察细胞。杭州四季星);2.5mol/LCaCl2;1×PBS缓冲液;15%甘1.2.2.2转染后培养时间的优化细胞转染后分别培基金项目:山东省自然科学基金项目(Y2000C09)资助收稿日期:2004-02-03;修订日期:2004-04-28作者简介:陈晓(1978-),女,硕士。E-mail:yuwg66@ouc.edu.cn联系人:Tel:(0532)82031680,Fax:(0532)82033054808中国海洋大学学报2005年养0,2,4,6,8,10,12h,用15
8、%甘油休克4.5min,
