克伦特罗说明书

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1、RANDOX克伦特罗酶联免疫检测试剂盒(产品编号：CB1418)使用说明书一、试剂盒简介本试剂盒适用于组织、饲料及尿样内所含克伦特罗的定量测试。试剂盒性能稳定，操作便捷，灵敏度高。试剂盒包括以下内容：中文名称英文名称规格已包被抗体的酶标板（可拆式）MicrotitrePlate12×8孔稀释剂/洗涤缓冲剂（浓缩）（绿帽）DiLuent/WashBuffer（Conc.）1×32mL酶标记物抗原稀释剂（蓝帽）ConjugateDiluent1×20mL酶标记抗原（浓缩）Conjugate（Conc.）1瓶单组分底物/发色剂（棕色瓶）OneShotSubstrate1×

2、15mL标准液（黑色帽）Standards6×2mL反应终止液（蓝色帽塑料瓶）StopSolution1×15mL注：所有浓缩液均需稀释后使用，稀释方法见试剂制备及使用检测下限样品检测下限尿样0.1ng/mL组织0.5ng/g饲料3ng/g二、CB1418克伦特罗试剂盒检测原理1、在可拆解成条状的酶标板上，已包被了克伦特罗特异性抗体。2、标准液或样品中的克伦特罗会和酶标记物争夺酶标板上抗体的结合位点，形成抗体/抗原复合物或抗体/酶标抗原复合物。3、洗涤酶标板，除去游离的酶标记物。加上底物/发色剂。在一定的温度范围内，抗体/酶标抗原复合物催化底物/发色剂发生显色（蓝色

3、）反应。加入酸后，反应终止，同时反应物的颜色由蓝色转为黄色。4、颜色的深度与克伦特罗含量成反比。在450纳米（nm）波长的酶标仪上，可读出相应的吸光度值。三、样品制备（一）尿液样品制备尿样不用处理，清亮尿样直接测定（如果尿样有比较严重的浑浊，要过滤或离心直至得到清亮尿样）（二）组织样品制备（肝、肾、肌肉、视网膜）所需要的试剂：50mmol/L盐酸：一般购买的浓盐酸为10mol/L，所以用蒸馏水按体积比1（浓盐酸）：199（蒸馏水）进行稀释即可RANDOX500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：例如用6.8g磷酸二氢钾固体溶于100mL蒸馏水中，再用强酸调pH值到3.05

4、0mmol/L磷酸二氢钾缓冲液：用500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液稀释十倍，再检查pH值是否为3.01mol/L氢氧化钠：例如用4.0g氢氧化钠固体溶于100mL蒸馏水甲醇(100%)：一般市场上购买的产品达到分析纯即可所需要的仪器：冷冻离心机：要有50mL的离心管和相应的转子均质器：要求转数在4000转以上样品前处理步骤：1.5g粉碎的样品与25mL50mmol/LHCL混合，振荡1.5小时，以达到均质的目的。2.称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中3.离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15OC（50-59℉）4.转移上清液到另一个离心瓶中，

5、加300uL1mol/L氢氧化钠混合15分钟.5.加入4mL500mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH3.0，简单的混合并在4O℃保存至少1.5小时或过夜6.离心15分钟/4000g或更高的转速，在10-15OC（50-59℉），分离全部上清液（应该是清亮的，非常重要），使其升至室温（20-25℃），然后用以下方法进行C-18柱纯化C-18柱纯化方法：（1）用3mL甲醇（100%）洗涤柱子，流速为1滴/每秒（2）用2mL50mmol/L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/每秒（3）样品进柱（肝，肉，或组织的全部上清液），流速为1滴/4每秒（4）用2mL50mmol/

6、L磷酸二氢钾缓冲液洗涤液过柱，流速为1滴/每秒（5）用正压去除残留的流体并且用空气或氮气吹2分钟干燥柱子（6）用1mL甲醇（100%）洗脱样品，流速为1滴/4每秒（7）在50-60℃并且在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇（8）用1mL蒸馏水溶解干燥的残留物进行分析注意:A.所有试剂和样品处理必须在室温条件下（20-25℃）并严格控制过柱时的流速B.在第（7）步中如果很难蒸发干甲醇，说明含有一定的水分，原因主要出在第（5）步中没有吹干柱子或甲醇本身有质量问题C.最后处理完的样品可能有黄色，属于正常现象，不影响以后的实验D.未处理的样品冷冻保存E.HCL均质后的样品在2-8

7、℃稳定3天F.以磷酸二氢钾缓冲液提取后的样品（C18柱纯化之前）在2-8℃稳定2天,使用前离心G.C-18柱纯化步骤6所获得的甲醇洗脱物可以冷冻保存数周,在2-8℃稳定2周视网膜样品应该采用以下方法快速抽提：1)称取0.1g视网膜，加入贴有标签的聚苯乙烯容器中或玻璃试管中。2)加入1.25mL用双蒸馏水配制的0.1﹪十二烷基磺酸钠溶液。RANDOX1)涡旋振荡至少30秒钟。2)加入5mL叔丁基亚甲基醚（TBME）和100μL饱和氯化钠溶液。3)涡旋振荡3分钟。4)2000rpm离心分离10分钟。5)在TBME层移取4mL样到干净的玻璃试管中，50℃温度下，用空气