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《hbv抗原肽-hla-a0201五聚体流式细胞技术检测慢性hbv感染患者特异性cd8t细胞》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、HBV抗原肽-HLA-A0201五聚体流式细胞技术检测慢性HBV感染患者特异性CD8+T细胞刘先进1吴月平1张红春2韩刚1沈张平2宋健辉2季沈杰2陈琳1（1南通市第三人民医院226006；2启东市人民医院江苏南通226006）【摘要】R的研宄不同临床感染状态慢性HBV患者外周血HBV特异性CD8+T淋巴细胞（CTL）频率的变化及临床价值。方法采用HBcAgl8-27表位肽-HLA-A*0201五聚体（MHCPentamers）及CD8单克隆抗体，设计流式细胞技术检测外周血屮针对该肽段的特异性CTL数量，以占总计数CD84•细胞数的
2、百分比表示，同时对HLA-A2等位型进行鉴定。结果18例非HBV感染患者屮12例HLA-A2-（对照组）特异性CTL数为0.33%-3.90%,屮位数为1.04%。HLA-A2-的CHB、LC、HLA-A2+的CHB特异性CTL数为分别为0.25%-10.69%、屮位数1.60%、n=24,0.34%-12.20%>屮位数1.85%、n=13,0.20%-29.90%中位数1.41%、n=24,三者与对照组无显著差异。HLA-A2-的PHC、HLA-A2+的LC、PHC特异性CTL数分别为1.27%-20.30%>屮位数6.69%
3、、n=5,0.14%-18.40%>屮位数2.88%、n=18,0.72%-39.22%、屮位数1.33°%、n=7,三者显著高于对照组。HLA-A2-抗病毒治疗者特异性CTL数显著高于相应未抗病毒治疗者。HLA-A24•未抗病毒组屮血清HBVDNA<103copies/mL、ALT<40IU/L者特异性CTL频率有增高趋势。结论HBV抗原肽-HLA-A*0201五聚体流式细胞技术能在体外直接检测外周血HBV特异性CTL频率的变化，其水平一定程度反映不同临床感染状态慢性HBV感染患者T淋巴细胞对特异性抗原表位免疫应答的
4、差异。【关键词】HLA-A2抗原MHC-五聚体CD8+T淋巴细胞流式细胞术【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）24-0032-03乙型肝炎病毒（HBV）病毒本身及其在体
5、Aj的复制并不引起肝细胞的损伤,它的发病机制主要是机体清除HBV而引发的细胞免疫病理改变，而特异性细胞（T辅助细胞、细胞毒性T细胞）免疫机制可能是乙型肝炎发病机制的中心环节；CTL活化以及生物学效应都严格受HLA-I限制，不同HLA-I等位型个体可以有不冋的抗原表位，研究抗原特异性CTL必须结合具体HLA-I等位型。我们
6、采用的表位肽是针对HLA-A*0201等位型个体（与HLA-A2相同），在四聚体基础上改进的五聚体（MHCpentamers）法结合流式细胞技术定量分析不同临床感炎状态慢性HBV患者外周血抗原特异性CTL，探讨其临床应用价值。1材料和方法1.1研究对象91例慢性HBV感染患者中48例慢性乙肝（CHB）、31例肝硬化（LC）、12例原发性肝癌（PHC）,诊断符合2000年第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎诊断标准。所有患者均排除甲、丙、丁、戊型肝炎病毒以及CMV、EB病毒、HIV感染，无自身免疫性疾病，无嗜洒史，无肝
7、毒性药物使用史，其中51例进行核苷类药物抗病毒治疗。以18例手足口病、妊娠肝损害、洒精性肝炎、丙型肝炎、戊型肝炎等非HBV感染者作对照。1.2主要试剂及来源FITC结合鼠抗人HLA-A2单克隆抗体购自Serotec公司。FITC结合的鼠抗人CD8单克隆抗体、溶血素购自BDPharmingen公司，HLA-A*0201限制HBV抗原表位肽-五聚体复合体（Pro5TMMHCPrenamers）购自英国Proimmune公司，所含HBV抗原表位肽为HBcAg18-27,序列为FLPSDFFPSV。HBV血清标志物HBsAg、HBsAb、
8、HBeAg、HBeAb、HbcAb检测试剂购自美国Abbott公司，血清HBVDNA含量检测采用上海科华试剂，检测限103copies/ml。1.3HLA-A2等位型的鉴定采用流式细胞术，所有研究对象取100ul肝素钠抗凝新鲜全血,加入检测管和对照管，分别加入HLA-A2单兑隆抗体及同型对照10ul,16-27°C,避光放置30min,经溶血、FACS洗涤液洗涤,FACS固定液固定,4°C保存，用于流式细胞仪检测，同吋每份标本均设阴性对照。1.4五聚体和CD8染色所有研究对象分设双阴性对照管、五聚体阴性和CD8阳性对照管、五聚体和
9、CD8双阳性检测管，每管取新鲜肝素钠抗凝全血100ul,加入lulMHC五聚体和10UICD8单克隆抗体以及相砬的同型对照混匀，避光冰上孵育30min,加2mll×FACS裂解液室温10min,待细胞悬液变成真性溶液后,PBA液（含5g
