低温冻存habmscs修复兔颅骨缺损的实验研究

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1、低温冻存HABMSCs修复兔颅骨缺损的实验研宄王富强张继波孔令菊刘建生郑德宇(辽宁医学院解剖学教研室辽宁锦州121001)【摘要】目的：通过深低温冻存自行构建的人工植骨材料多孔羟基磷灰石(hydroxyapatiteceramic,HA)/骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,BMSCs)修复兔频骨缺损，探讨深低温冻存(Cryopreservation)方法对保存HA复合植骨材料的可行性，以方便临床使用。方法：应用无菌培养法获得BMSCs与羟基磷灰石HA复合培养，获得复合植骨材料培养构成人工植骨材

2、料。应用-80°C保存3个只的HA/BMSCs修复兔颅骨12mm缺损模型，同时以未行低温冻存的HA/BMSCs及单纯的HA分别为对照组1和2。在术后第12周进行大体观察、X线观察和HE染色等组织学观察。结果：BMSCs与多孔HA构建出人工植骨材料，BMSCs在HA表面生存良好。三组模型在术后12周实验组和对照1组的骨缺损处愈合大部，有成熟骨小梁通过，有的可见髓腔通畅，塑形较好；对照2组骨痂生成少，骨缺损部分愈合，塑形欠佳，新骨生成有统计学差异(P值<0.05)。结论：低温冻存的复合植骨材料的骨缺损修复能力与新制作的复合材料几乎一致，没有因为冻存而受

3、到影响。【关键词】骨髓间充质干细胞羟基磷灰石支架材料复合物低温冻存颅骨缺损【中图分类号】R322-33【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2012)08-0392-03刖目临床上，创伤、肿瘤以及感染等疾患引起的大块骨缺损相当普遍，骨缺损的治疗一直是骨科难题之一［1-2］,国内外学者进行了广泛的实研宄与临床实践。异种、同种异体、自体及人工合成物质作为修复材料在免疫排斥、材料来源、医学伦理及继发感染等方面的问题目前尚难消除另［3］。应用组织工程的方法构建人工植骨材料是修复大面积骨缺损的有效方法，但是根据骨组织工程方法，从设计、细胞培养等到最后获得

4、组织工程骨需要复杂的过程，体外构建需要一定的时间，不能满足临床上即刻应用骨缺损修复的要求［4-5】。同吋，随着组织工程研究的深入，组织工程产品的产业化、市场化的需要使其保存也成为新的研究课题,探索标准化的保存方法，研究组织工程骨的冇效保存技术对于组织工程开发和临床应用至关重要［6-8］。在以往的研究中，奋低温保存颅骨骨瓣修复颅骨缺损获得成功的报道［9】。本研究拟低温保存自行构建的轻基磷灰石（hydroxyapatite，HA）/骨髓间充质干细胞（bonemarrowderivedmesenchyamlstemcell,BMSCs）修复兔卢页骨缺损，探讨深

5、低温冻存下的HA支架材料复合物修复骨缺损的能力以及深低温保存支架材料复合物的可行性。1.实验材料与方法1.1实验动物日本大耳白乳兔5只，健康2月龄日本大耳白兔18只，体重2kg，雌雄不限，由辽宁医学院动物实验中心提供。1.2实验方法1.2.1骨髓间充质干细胞的分离培养无菌条件下从1日龄健康乳兔股骨和胫骨中分离培养BMSCs，用完全培养基（青霉素200u/ml,链霉素200mg/mg,DMEM,15%FBS）冲洗减去两端骨骺的骨干，所得冲洗液1200r/min离心10分钟，吸弃上清，所得细胞沉淀以l×106/ml密度接种于培养瓶中,于37°C、

6、5%C02条件下的培养箱内进行，72小吋半量换液，以后每2天换液一次。待细胞相互融合达80%生长面积吋用0.25%胰蛋白酶进行第一次传代培养。1.2.2复合植骨材料的构建取106个BMSCs,约lmI与预先用DMEM培养液中浸泡24h后的无菌HA柱（直径1.2cm,厚约2mm）共培养7天。应用扫描电镜观察BMSCs在HA表面的形态、生长状况及胶原分泌情况。1.2.3复合植骨材料的冻存与复苏将培养1周的支架材料复合物移入含冇DMEM保存液（10%DMSO,20%FBS的DMEM培养基）的冻存管中，于4°C环境预冷lh后，将冻存管置于-80°C冰箱中保存3个

7、月。3个月后，取出冻存管，快速置于37°C水浴箱中快速复温至保存液完全融化，置于37°C、5%CO2饱和湿度条件下培养过夜。将部分标本应用扫描电镜观察BMSCs在HA表面的形态、生长状况。1.2.4实验动物造模及复合支架移植在无菌条件下分别应用冻存后的复合材料（实验组）、新制备的复合材料（对照1组）和单纯HA（对照2组）修复兔颅骨1.2cm缺损。术后前3天，连续肌注青霉素80万单位/天，分二次注射。术后12周处死动物，并进行大体观察、X—线检测和HE染色检测骨缺损修复水平。1.3统计学分析采用SPSS16.0软件包进行统计学处理，实验数据以均数x-&pl

8、USmn;S标准差表示；组间计量资料行配对t检验，P<0.05为有统计学意义。2