ecm修复兔桡骨缺损的实验研究

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1、ECM修复兔桡骨缺损的实验研究【摘要】研究自制的兔耳廓脱细胞软骨基质（extracellularcartilagematrix，ECM）修复骨缺损的特点及机理。［方法］采用新西兰大白兔共40只，随机分A、B两组，在其两侧桡骨干中段制作5mm的骨缺损模型。右侧作为实验侧，缺损区A组植入脱细胞软骨基质复合自体培养骨髓干细胞，B组仅植入脱细胞软骨基质，左侧为空白对照。分别于2、4、6、10周处死动物，标本行放射学及组织学检查。［结果］X线及组织切片均证实复合体在6周时已有致密骨组织形成，10周时已有新生髓腔生成。［结论］表明兔耳廓脱细胞软骨基质与自体骨髓干细

2、胞复合体有良好的成骨能力，有引导组织再生、防止骨不连作用。【关键词】骨缺损骨移植脱细胞软骨基质软骨细胞Abstract：［Objective］Thecharacteristicsandmechanismofthebonedefectrepairatrix（ECM）:AandBontherightside,thedefectesenchymalstemcells（MSCs）,theECMinthegroupsAandB,respectively.Thedefectsontheleftsideservedascontrolscorrespondingly.

3、Therabbitsplesentalsidesthebonedefectsembranousossificationandentochondrostosis.［Conclusion］ItissuggestedthattheplexofECMandautologousMSCshastheeffectsonguidingboneregenerationandpreventingfromnonunion.Keyatrix（ECM）;chondrocyte临床上长段骨缺损造成的骨不连较常见。骨缺损的修复材料很多，自体骨移植修复效果虽理想，但其来源有限。如何选

4、择一种材料来提高骨缺损修复效果，这是人们正在研究的重点。作者采用经胶原酶-去垢剂处理，去除抗原性成分的兔耳廓软骨复合自体软骨细胞植入兔桡骨干缺损，分别于2、4、6、10周观察骨的修复能力。具体报告如下。1材料和方法1.1材料新西兰大白兔（购自华中科技大学同济医学院动物试验中心），共40只，均为雄性，月龄为2~3个月，体重2.0~2.5kg。1.2兔耳廓ECM的制备切取2月龄兔的双侧耳廓，去除皮肤及软骨膜，新鲜软骨用PBS液冲洗3遍，采用去垢剂酶四步法〔1〕对软骨进行脱细胞处理：（1）将新鲜软骨置入Tris低渗缓冲液中，缓冲液中含有蛋白酶阻断剂，4℃恒

5、温震荡48h；（2）1％TritonX100、Tris缓冲剂抽提48h后，以蒸馏水连续冲洗24h；（3）DNaseⅠ和RNaseⅠ混合后，在37℃下消化2~4h：（4）再次用1％TritonX100、Tris缓冲剂抽提48h，取出后所有标本用DHanks生理盐溶液4℃下彻底清洗24~48h。完成了对软骨脱细胞处理后，置于无菌PBS液中保存备用。1.3骨髓干细胞的分离和培养按Kadiyala等〔2〕描绘的方法，取健康2个月龄新西兰大白兔，氯胺酮和异丙嗪肌注麻醉，双侧髂部剪毛后碘伏消毒，在无菌条件下用16号骨穿刺针在髂骨翼外侧穿入骨髓腔，注射器针管内

6、预先含有0.1ml肝素钠生理盐水，抽吸骨髓液6ml移入Mc5A培养液5ml的离心管内混匀，1500r／min离心5min，弃上层脂肪和上清。加入适量无血清培养液悬浮细胞，缓慢移入盛有比重为1.077淋巴细胞分离液的离心管中（细胞培养液与细胞分离液之比1∶1），以2000r／min离心20min，小心吸取界面的有核细胞乳白层，加入Mc5A培养液10ml，制成细胞悬液移入25cm2培养瓶中，置于37℃5％CO2及饱和湿度培养箱中培养，倒置显微镜下观察呈形态一致的均质的分布均匀的细胞，可用于MSCs收集和移植〔4、5〕，计数每瓶中含有细胞1.5×105个／m

7、l时，收集的骨髓MSCs低温存储中。1.4动物模型的制备2~3个月龄的新西兰大白兔40只，均为雄性，体重2.0~2.5kg，随机分为2组，每组20只，在其双侧桡骨中段，咬去5mm桡骨造成骨缺损模型，右侧作为实验侧，左侧为空白对照，A组中右侧缺损区植入脱细胞软骨基质复合自体培养软骨细胞，B组仅植入脱细胞软骨基质，分别于2、4、6、10周处死动物，标本行放射学及组织学检查。1.5放射学检查术后第4、6、10周分别于同样条件下拍X线片观察骨缺损修复情况。因为ECM不显影，如果出现密度增高影即表示有新骨形成。对12周的X线片根据骨缺损内生骨面积行X线等级疗效评

8、估〔3〕。100％为5分，75%~99％为4分，50%~74％为3分，25％~49％为2分，1