肝硬化患者外周血ip10及其mrna表达与血清转氨酶水平关系

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1、肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达与血清转氨酶水平关系：王平平,高凤兰,王健,项桂菊,胡孝彬【摘要】　　目的:探讨肝硬化患者外周血IP10、IP10mRNA的表达及其与转氨酶水平的关系。方法:筛选典型HBV感染后肝硬化患者,以ELISA法检测患者血清IP10水平;RealtimePCR检测IP10mRNA含量,以lgcDNA/lgGAPDH代表其mRNA水平。结果:肝硬化患者血清IP10及PBMC中IP10mRNA水平分别为(299.3±77.2)ng/L、0.7479±0.1495,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01);A

2、LT、AST升高组外周血IP10及其mRNA升高,与转氨酶正常组相比差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。升高组中IP10与ALT、AST及ALT/AST比值存在相关(r=0.6284,0.7162,0.6970,P<0.01)。结论:肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达增高,与肝细胞损伤程度密切相关,在介导肝炎后肝硬化进展中起重要作用。【关键词】肝硬化IP10mRNAPCR外周血转氨酶　　肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生,是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。IFNγ诱生蛋白10(interferonγin

3、ducibleprotein10,IP10)是1985年Luster等用IFNγ刺激U937细胞株,从cDNA基因库中筛选出,属CXC家族ELR亚族,可由IFNγ、LPS等诱导产生,介导Th1型炎症反应,抑制血管新生及肿瘤生长。丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)及其AST/ALT比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标[1]。为了解IP10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用,筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者,探讨其外周血IP10及其mRN

4、A水平,现将结果报道如下。　　1材料和方法　　1.1材料FicollHypaque分离液购自上海试剂二厂;HBVDNA诊断试剂购自上海中亚基因研究所;ELISA法IP10试剂盒购自法国DLACLONE公司;TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;cDNA合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司;半自动生化仪EF6124购自德国Eppendorf公司;EXL808全自动酶标仪和EXL50X全自动洗板机购自美国BioTek公司;LightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenⅠ购自德国Roche公司;iCycle荧光实时定量PCR仪

5、购自美国BioRad公司。　　1.2检测对象39例肝硬化患者为2006-01/2007-05我校教学医院收治的患者。其中男27例,女12例,年龄31.2～62.5岁,平均44.5岁,ALT升高者18例,AST升高者24例,AST/ALT>1.0者27例;入选患者均为HBV感染者,临床诊断符合2005年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准,病程均超过6个月,无合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV感染的实验室依据,无其他自身免疫性疾病,3个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组,其中男16例,女9例,年龄20.3～42.9岁,平均3

6、2.0岁。　　1.3方法　　1.3.1标本采集分批采取患者晨起空腹静脉血5mL,分别置2支含肝素的无菌Eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以FicollHypaque常规分离外周血单个核细胞(PBMC),普通管常规分离血清备检。　　1.3.2血清IP10检测采用ELISA以试剂盒提供标准品绘制标准曲线,每批检测设空白、阴性、阳性对照各2孔,取100μL待测血清和100μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗趋化因子单克隆抗体(mAb),加至包被有趋化因子mAb的酶标反应板孔内,37℃孵育1h,PBS缓冲液洗涤5次,加100μL底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸盐,室温

7、30min,加2mol/LH2SO4终止反应,在EXL808全自动酶标分析仪上(450±2)nm处读取A值,每孔测定2次,取均值,依标准曲线确定血清IP10含量。IP10最低检测水平<2ng/L,且批内和批间变异系数分别为<5%和<7%。　　1.3.3IP10mRNA检测采用RealtimePCR法。将分离的PBMC以RPMI1640培养液调整细胞数至(1～2)×109个/L悬液;以TRIzol试剂抽提PBMC总RNA,并逆转录为cDNA,置-86℃冰箱