浅谈肝硬化患者外周血ip10及其mrna表达与血清转氨酶水平关系

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1、从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果浅谈肝硬化患者外周血IP10及其mRNA表达与血清转氨酶水平关系【摘要】　　目的:探讨肝硬化患者外周血IP10、IP10mRNA的表达及其与转氨酶水平的关系。方法:筛选典型HBV感染后肝硬化患者,以ELISA法检测患者血清IP10水平;RealtimePCR检测IP10mRNA含量,以lgcDNA/lgGAPDH代表其mRNA水平。结果:肝硬化患者血清IP10及PBMC中IP10mRNA水平分别为(±)ng/L、±,与对照组相比差异有统计学

2、意义(P【关键词】肝硬化IP10mRNAPCR外周血转氨酶肝硬化是肝脏纤维结缔组织弥漫性增生伴有肝细胞结节状再生,是肝细胞在多因素作用下反复损伤的慢性病理过程。IFNγ诱生蛋白10(interferonγinducibleprotEin10,IP10)是1985年Luster等用IFNγ刺激U937细胞株,从cDNA基因库中筛选出,属CXC家族ELR亚族,可由IFNγ、LPS等诱导产生,介导Th1型炎症反应,抑制血管新生及肿瘤生长。丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)与天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase

3、,AST)及其AST/ALT比值能判断肝病进展及肝病预后的较好指标[1]。为了解IP10与血清转氨酶水平关系及其在肝硬化发病机制中的作用,筛选39例慢性乙肝后肝硬化患者,探讨其外周血IP10及其mRNA水平,课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果现将结果报道如下。1材料和方法材料FicollHypaque分离液购自上海试剂二厂;HBVDNA诊断试剂购自上海中亚基因研究所;EL

4、ISA法IP10试剂盒购自法国DLACLONE公司;TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司;cDNA合成试剂购自上海申能博采生物科技有限公司;半自动生化仪ECOMF6124购自德国Eppendorf公司;EXL808全自动酶标仪和EXL50X全自动洗板机购自美国BioTek公司;LightCyclerFastStartDNAMasterSYBRGreenⅠ购自德国Roche公司;iCycle荧光实时定量PCR仪购自美国BioRad公司。检测对象9例肝硬化患者为XX-01/XX-05我校教学医院收治的患者。其中男27例,女12例,年龄～岁,平均岁,ALT升高者18例,

5、AST升高者24例,AST/ALT>者27例;入选患者均为HBV感染者,临床诊断符合XX年全国病毒性肝炎会议修订诊断标准,病程均超过6个月,无合并HAV、HCV、HDV、HEV、HIV感染的实验室依据,无其他自身免疫性疾病,个月内未系统使用抗病毒和免疫抑制剂治疗。另选25例本市中心血站体检正常献血员为对照组,其中男16例,女9例,年龄～岁,平均岁。方法标本采集分批采取患者晨起空腹静脉血mL,课题份量和难易程度要恰当，博士生能在二年内作出结果，硕士生能在一年内作出结果，特别是对实验条件等要有恰当的估计。从本学科出发，应着重选对国民经济具有一定实用价值和理论意义的课题。课题具有先进性，便于研

6、究生提出新见解，特别是博士生必须有创新性的成果分别置2支含肝素的无菌Eppendorf管和2支灭菌普通管。肝素抗凝血以FicollHypaque常规分离外周血单个核细胞(PBMC),普通管常规分离血清备检。血清IP10检测采用ELISA以试剂盒提供标准品绘制标准曲线,每批检测设空白、阴性、阳性对照各2孔,取100μL待测血清和100μL辣根过氧化物酶标记的抗趋化因子单克隆抗体(mAb),加至包被有趋化因子mAb的酶标反应板孔内,7℃孵育1h,PBS缓冲液洗涤5次,加100μL底物33甲基苯并噻唑啉6磺酸盐,室温30min,加mol/LH2SO4终止反应,在EXL808全自动酶标

7、分析仪上(450±2)nm处读取A值,每孔测定2次,取均值,依标准曲线确定血清IP10含量。IP10最低检测水平IP10mRNA检测采用RealtimePCR法。将分离的PBMC以RPMI1640培养液调整细胞数至(1～2)×109个/L悬液;以TRIzol试剂抽提PBMC总RNA,并逆转录为cDNA,置-86℃冰箱备检。以SYBRGreenⅠ荧光标记法检测PCR产物,总反应体系2μL,包括上下游引物各10pmol,/L,E