midkine mrna在食管鳞癌患者外周血中的表达及其临床意义

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1、MidkinemRNA在食管鳞癌患者外周血中的表达及其临床意义作者：胡俊,田小强,商延芳,刘飞,刘全俊,黄培林【摘要】目的:探讨靶基因中期因子(MK)在食管鳞癌患者外周血中的表达及其与食管鳞癌生物学行为的关系。方法:采用巢式RTPCR方法检测54例食管鳞癌患者外周血的MKmRNA。10例正常健康志愿者外周血为阴性对照，11例食管鳞癌肿瘤组织为阳性对照。结果:54例食管鳞癌患者外周血MKmRNA阳性率为61.11%(33/54)，并与食管鳞癌患者淋巴结转移有显著相关性(P<0.05)，而健康成人外周血则无一例出现阳性。结论:应用巢式RTPC

2、R方法检测食管癌患者外周血中的MKmRNA具有较高的敏感性和特异性，它有望成为判断食管鳞癌恶性程度、转移、复发和监测疗效的客观指标。【关键词】中期因子;食管鳞癌;外周血;肿瘤标志物;生物学行为研究表明，恶性肿瘤在侵袭和转移的早期阶段就有癌细胞入血，即微转移（micrometastasis），它是肿瘤的恶性标志和主要特征之一，也是导致治疗失败和患者死亡的主要原因之一。因此，早期诊断肿瘤微转移是提高恶性肿瘤治疗效果、改善患者预后的有效途径之一[12]。而巢式RTPCR可在1×10107个单个核细胞中检出1～10个肿瘤细胞，其敏感性、特异性远高于其他

3、方法[3]。迄今为止，国内外尚未见食管鳞癌患者外周血中期因子(midkine，MK)mRNA表达情况的研究报道。本研究拟用巢式RTPCR方法检测食管鳞癌患者外周血的MKmRNA表达，并探讨其与食管鳞癌生物学行为的关系。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1样本54例食管鳞癌患者均为东南大学附属中大医院胸外科2004~2006年的住院患者，所有病例均经病理确诊；男40例，女14例；年龄46～83岁，平均63.4岁。取术前患者外周血3ml。以11例食管鳞癌肿瘤组织标本为阳性对照，10例健康志愿者外周血为阴性对照。　　1.1.2试剂淋巴细胞分离液

4、和DEPC为南京生兴生物技术有限公司产品，Trizol试剂、RTPCR试剂盒及Taq酶等为日本TaKaRa公司产品。　　1.1.3引物参照有关文献，采用Primer5引物设计软件自行设计，所有引物均由江苏百龙基因有限公司合成。引物序列见表1。　　表1βactin和MK基因的引物序列（略）10　　Tab1PrimersequencesofβactinandMK　　1.2方法　　1.2.1样本处理及总RNA提取抽取术前患者外周静脉血3ml，以枸橼酸钠抗凝，用淋巴细胞分离液按密度梯度离心法常规分离单个核细胞。肿瘤组织以匀浆器研碎得细胞悬液。Triz

5、ol一步法分别提取总RNA20μl，将提取的RNA于紫外分光光度计上定量，并行10%琼脂糖凝胶电泳，以明确RNA未降解。　　1.2.2逆转录合成cDNA和PCR扩增所有标本各取5μlRNA，70℃6min变性，根据TaKaRaRNA试剂盒进行cDNA第1链合成，行MK巢式PCR。第1轮PCR：取cDNA5.0μl，10×PCRbuffer2.5μl，25mmol·L－1MgCl20.5μl，10mmol·L－1dNTP0.5μl，10pmol·L－1第1轮PCR上、下游引物各2.5μl，TaqDNA聚合酶1.25U，加灭菌水至25μl。反应条件：

6、94℃5min预变性；94℃30s，60℃30s，72℃60s，30个循环；72℃5min延伸。第2轮PCR：取第1轮PCR产物2.0μl作模板，加10pmol·L－1第2轮PCR上、下游引物各2.5μl，除退火温度改为53℃外，余反应体系及反应条件同前。选择βactin基因作为内参照质控指标。PCR反应中加入其上、下游引物各2.5μl，扩增条件除退火温度改为56℃10外，余反应体系及反应条件同前，但只进行1轮扩增。　　1.2.3RTPCR产物鉴定将第1轮PCR产物双向测序，并取第2轮MKPCR产物及βactinPCR产物各5μl加样于1.5

7、%琼脂糖凝胶进行电泳，电压80V，电泳约25min，然后用紫外光凝胶成像系统扫描并拍照。在相应位置(531、272bp)出现肉眼可见条带判为阳性(图1)。MK产物带272bp，βactin产物带531bp　　M.Marker；1.肿瘤组织阳性对照；2.健康捐献者外周血阴性对照；3～7.患者外周血　　图13种标本PCR产物琼脂糖凝胶电泳示例（略）　　Fig1ExampleofthreekinesofPCRproductsseparatedbygelelectrophoresis　　1.3统计学处理用SPSS软件分析各组数据，P<0.05为差异

8、有统计学意义。　　2结果　　2.1MKmRNA测序结果PCR产物采用上、下游引物进行双向测序，结果如下：5′ATGCAG