熊胆冻干粉针剂对缺氧

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1、熊胆冻干粉针剂对缺氧金光显，任香善，林贞花，宋京郁，玄延花，金贤国【关键词】熊胆；,,血管内皮；,,丙二醛；,,一氧化氮　　摘要：目的探讨熊胆冻干粉针剂对缺氧-再复氧损伤的血管内皮细胞的保护作用及抗动脉粥样硬化机制。方法采用脐静脉血管内皮细胞（humanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）体外原代培养方法。通过倒置相差显微镜观察和比较，各组内皮细胞形态，用MTT法检测吸光度值，利用比色法测定细胞上清夜中的丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nit

2、ricoxide，NO）含量。结果MTT法结果显示：正常组、熊胆组与缺氧－再复氧组比较有显著差异（P0.01）。缺氧-再复氧组的MDA含量增高，而NO含量降低，正常组和熊胆组中检测结果相反。结论熊胆冻干粉针剂对缺氧－再复氧损伤的血管内皮细胞有保护作用。　　关键词：熊胆；血管内皮；丙二醛；一氧化氮　　ProtectiveEffectsoftheLyophiledPoechanismsofanti-atherosclerosis.MethodsByusingprimarycultureofhumanumbi

3、licalveinendothelialcells(HUVEC)invitro,theVECsorphologicalchangesofVECbytheinvertedmicroscope,theopticaldensity(OD)valueofcellsetricmethod,contentofMDAandNOinthesupernatantfluidofculturedcellsetry.ResultsTheMTTassayshoalgroup,bearbilegroupandhypoxia-reo

4、xygenationgroup.TheMDAcontentincreasedandNOcontentdecreasedinthehypoxia-reoxygenationgroup,incontrast,MDAcontentdecreasedandNOcontentincreasedinthenormalandbearbilegroups.ConclusionTheresultsindicatethatthelyophiledpoanumbilicalveinendothelialcell，HUVEC）

5、，以酶消化法取得。　　1.1.2试剂与主要仪器熊胆冻干粉针剂由延边大学药学院提供。人第八因子相关抗原（Ⅷ因子）是美国Santacruz产品，一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）检测试剂盒购置于南京建成生物有限公司。M199培养基为美国GIBCO公司产品；胎牛血清为美国HYCOLONE公司产品；连二亚硫酸钠为沈阳市东兴试剂；MTT为SIGMA公司产品。倒置相差显微镜，日本OLYMPUS产品，37度CO2培养箱是德国SL产品。　　1.2方法　　1.2.1脐静脉内皮细胞的分离及培养按Jaffe等〔1，2〕的方法

6、略加修改进行。在无菌条件下，取健康产妇分娩后6h以内的脐带，灌注0.1%Ⅰ型胶原酶（collagenaseⅠ）10～15ml，置37℃水浴中孵育15～20min。收集含有细胞的酶液，放入离心管中,1000r/min离心10min,沉淀中加入含有20％FBS，50U/ml肝素、终浓度为2mg/ml的L谷氨酰胺的完全M199培养液5ml，充分混合制成细胞悬液，以（1.5~2.0）×104/cm2密度植入培养瓶中，置37℃，5％的CO2培养箱中培养，待细胞长成融合状态后进行鉴定。　　1.2.2分组及药物处理实

7、验随机分为3个组：分别为缺氧-再复氧组，正常组和熊胆组。熊胆组的熊胆终浓度分别为60，80，120μg/ml和160μg/ml。细胞缺氧－再复氧损伤造模法：根据文献〔3〕略加修改，采用氧清除剂连二亚硫酸钠造成缺氧，种板培养24h后，各孔弃去培养基，用无糖Earls液洗细胞2次，正常对照孔加入M199培养基；模型孔加入含连二亚硫酸钠终浓度为1.0mmol/L的无糖Earls液，缺氧4h后加入完全M199继续培养12h，造成细胞缺氧再复氧损伤模型。熊胆组加入含连二亚硫酸钠终浓度为1.0mmol/L的无糖Ea

8、rls液，缺氧4h后加入终浓度分别为60，80，120，160μg/ml的熊胆，37℃孵育12h。　　1.2.3MTT法检测内皮细胞存活率取对数生长期的细胞制备细胞混悬液，接种于96孔培养板内，细胞浓度为（1～5）×105/ml，每组设8个平行孔，细胞处理同上。细胞置5％CO2培养箱孵育24h，待细胞贴壁及基本长满时开始做试验。吸弃个孔液体，加入无血清M199培养基100μl，再加入5mg/mlMTT工作液20μl，混匀，37℃孵育4h。翻